孫秀超，買爾旦·玉蘇甫，張　健，魯彥坤，潘　佳，努爾威亞·努爾買買提，陶威熔，賽義德·謝卜利·艾哈邁德，魏媛媛

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室;2第一臨床醫(yī)學(xué)院；3國際教育學(xué)院；4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,烏魯木齊　830011)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究·

石榴花多酚對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用的影響

孫秀超1，買爾旦·玉蘇甫1，張健2，魯彥坤2，潘佳2，努爾威亞·努爾買買提2，陶威熔2，賽義德·謝卜利·艾哈邁德3，魏媛媛4

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室;2第一臨床醫(yī)學(xué)院；3國際教育學(xué)院；4基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,烏魯木齊830011)

摘要:目的研究石榴花多酚(Pomegranate Flower Polyphenol，PFP)對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒縮功能的影響及作用機(jī)制。方法采用離體血管環(huán)灌流法觀察(100～900)mg/L PFP對大鼠胸主動脈環(huán)張力的影響，給予鉀通道阻斷劑和一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，測定大鼠血管組織中所含一氧化氮的含量。結(jié)果當(dāng)PFP濃度為(700～900)mg/L時，與內(nèi)皮去除組比較，內(nèi)皮完整組PFP對大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。鉀通道阻斷劑格列本脲(Glib，10 μmol/L)、四乙基氯化銨(TEA，3mmol/L)、氯化鋇(BaCl2，100 μmol/L)預(yù)處理均能抑制PFP對內(nèi)皮去除大鼠胸主動脈環(huán)的舒張效應(yīng)。PFP對無鈣高鉀液中Ca2+收縮曲線和無鈣液中PE引起的內(nèi)鈣釋放均有抑制作用。一氧化氮合酶抑制劑L-NAME預(yù)處理對PFP誘導(dǎo)的內(nèi)皮完整大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用具有抑制作用。結(jié)論石榴花多酚具有內(nèi)皮依賴性和內(nèi)皮非依賴性2種舒張血管作用。

關(guān)鍵詞：石榴花多酚；血管舒張；一氧化氮；鉀鈣通道；血管環(huán)

中圖分類號：R965

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-585-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.015

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81360669)

作者簡介：孫秀超(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：植物藥藥理。

通信作者：魏媛媛，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:植物藥藥理，E-mail：wei8923270@sina.com。

本文引用：孫秀超，買爾旦·玉蘇甫，張健,等.石榴花多酚對離體大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2018,41(5):585-589.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.015

Diastoliceffectofpomegranateflowerpolyphenolonisolatedratthoracicaorticrings

SUNXiuchao1,MaierdanYusufu1,ZHANGJian2,LUYankun2,PANJia2,NuerweiyaNuermaimaiti2,TAOWeirong2,SyedShibliAhmed3,WEIYuanyuan4

(1DepartmentofPharmacology,SchoolofPre-clinicalMedicine,2the1stSchoolofClinicalMedicine,3InternationalEducationInstitute,4DepartmentofPhysiology,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate diastolic effect of Pomegranate Flower Polyphenol(PFP)on isolated rat thoracic aortic rings and its mechanism.MethodsThe tension of isolated thoracic aortic rings of rats in presence or absence of PFP(100～900mg/L)were observed by vascular ring perfusion method in vitro,then the mechanism were explored by application of Ca2+&K+channel blockers and nitric oxide synthase inhibitor L-NAME.And the content of nitric oxide in rat vascular tissue was determined.ResultsWhen the concentration of PFP was(700～900)mg/L,PFP in the intact endothelium group had a stronger effect on rat thoracic aortic rings dilation than that in the group with endothelial deprivation(P<0.01).Diastolic effect on denuded rat thoracic aortic rings induced by PFP could be inhibited by pretreatment of K+channel blockers:10 μmol/L Glib,3mmol/L TEA and 100 μmol/L BaCl2.PFP could move the calcium-constriction curve to the right in calcium-free high-potassium solution,and inhibit intracellular calcium releasing induced by PE in calcium-free solution.Pretreatment with nitric oxide synthase inhibitor L-NAME inhibited relaxation of thoracic aortic rings with intact endothelium induced by PFP.ConclusionPFP has endothelium-dependent and endothelium-independent vasodilation effects.

Keywords:Pomegranate flower polyphenols;vasodilation;nitric oxide;potassium/calcium channel;vessel ring

石榴花為石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicL.)植物石榴(PunicgranatumL.)的干燥花瓣,富含安石榴苷、石榴鞣質(zhì)、鞣花酸、原花青素和沒食子酸乙酯等多酚類物質(zhì)[1]，具有良好的抗氧化及抗炎活性，臨床上多用于治療鼻衄、腹瀉、惡心嘔吐等多種疾病[2]。本課題組前期研究顯示石榴花多酚(PFP)具有降糖調(diào)脂抗氧化等功效[3-4]，通過測定血管活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)PFP可以有效降低糖尿病大鼠血漿中縮血管活性物質(zhì)內(nèi)皮素-1(ET-1)、血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)濃度、抗血栓素B2(TXB2)和6酮前列腺素1a(6-Keto-PGF1a)比值，提示PFP具有一定保護(hù)血管內(nèi)皮功能作用[5-6]。石榴鞣質(zhì)和原花青素還能夠抑制高糖引發(fā)的血管內(nèi)皮損傷[7-8]。本研究采用離體大鼠胸主動脈環(huán)模型探究石榴花多酚對離體大鼠胸主動脈舒張作用的影響，并分析其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器BL-420F型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，HV-4型恒溫離體組織器官灌流系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),X205BDU型電子天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)，Research Plus型微量移液器(德國艾本德儀器有限公司)。

1.2試藥乙酰膽堿(美國Sigma公司，批號BCBR3675V)，去氧腎上腺素(阿拉丁試劑有限公司，批號H1420012)，格列本脲(美國Sigma公司，批號SLBC7951V)，N-硝基-L-精氨酸甲酯(美國Sigma公司，批號WXBC2777V)，格列本脲用二甲基亞砜溶解，其他試劑均用超純水溶解。96T一氧化氮試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號AK0017NOV20016)。其他化學(xué)試劑均為分析純。Kreb-Henseleit(K-H)液的成分為：NaCl 118mmol/L,NaHCO325mmol/L,KCl 4.7mmol/L,KH2PO41.2mmol/L,MgCl21.2mmol/L,glucose 2 g/L,CaCl22.5mmol/L,pH=7.4。

1.3藥材石榴花采集于新疆和田地區(qū)，經(jīng)中科院新疆生態(tài)與地理研究所植物分類研究室沈觀冕研究員鑒定為石榴科植物石榴(PunicgranatumL.)的花。石榴花多酚由中科院新疆理化技術(shù)研究所提供。

1.4實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性SD大鼠體質(zhì)量(270±20)g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(新)2016-0003。

2　方法

2.1大鼠胸主動脈環(huán)模型的制備頸椎脫臼處死大鼠，快速將胸主動脈取出，放入4℃預(yù)冷的K-H液，清除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織后，剪成3mm的胸主動脈環(huán)備用。在胸主動脈環(huán)內(nèi)壁用牙簽來回滾動去除內(nèi)皮細(xì)胞為內(nèi)皮去除組，未去除內(nèi)皮細(xì)胞為內(nèi)皮完整組。將胸主動脈環(huán)置于37℃恒溫K-H液中，連接HV-4型恒溫離體組織器官灌流系統(tǒng)張力換能器，持續(xù)通入95%O2和5%CO2的混合氣體，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄胸主動脈環(huán)張力。1.0 g前負(fù)荷下平衡1 h,每15min換K-H液1次。平衡后加入KCl至60mmol/L，以達(dá)到最大張力，并以此檢查胸主動脈環(huán)的活性。用微量移液器加去氧腎上腺素(Phenylephrine,PE)至1 μmol/L預(yù)收縮胸主動脈環(huán)后，加入10 μmol/L的乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)使胸主動脈環(huán)舒張，當(dāng)舒張率達(dá)到80%以上認(rèn)為內(nèi)皮完整，當(dāng)ACh幾乎不能舒張血管時判定為內(nèi)皮去除。

2.2內(nèi)皮對PFP舒張血管作用的影響取12個內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為2組(內(nèi)皮完整對照組和內(nèi)皮完整PFP組)，取12個內(nèi)皮去除胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為2組(內(nèi)皮去除對照組和內(nèi)皮去除PFP組)，每組6個胸主動脈環(huán)。各組胸主動脈環(huán)按“2.1”項(xiàng)下方法平衡后，用1 μmol/L的PE 溶液將胸主動脈環(huán)預(yù)收縮至再次平衡，內(nèi)皮完整PFP組和內(nèi)皮去除PFP組依次累積加入 PFP(100、300、500、700、900mg/L)，每隔3min加1次藥。內(nèi)皮完整對照組和內(nèi)皮去除對照組加入等量K-H液，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定胸主動脈環(huán)張力。胸主動脈環(huán)舒張率用加入PFP后胸主動脈環(huán)舒張幅度與PE引發(fā)的最大收縮幅度之間的比值來表示，制作濃度舒張曲線。

2.3鉀通道阻斷劑對PFP舒張血管作用的影響取24個內(nèi)皮去除胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為4組(內(nèi)皮去除PFP組、內(nèi)皮去除Glib組、內(nèi)皮去除TEA組和內(nèi)皮去除BaCl2組)，每組6個胸主動脈環(huán)。內(nèi)皮去除Glib組、內(nèi)皮去除TEA組和內(nèi)皮去除BaCl2組胸主動脈環(huán)按“2.1”項(xiàng)下方法平衡后，分別用ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive K+channels，KATP)阻斷劑格列本脲(Glibenclamide,Glib)10 μmol/L、大電導(dǎo)鈣激活性鉀通道(large conductance calcium activate K+channels，BKCa)阻斷劑四乙基氯化銨(Tetraethylammonium,TEA)3mmol/L、內(nèi)向整流性鉀通道( Inward rectifier K+channels，Kir)阻斷劑氯化鋇(BaCl2)100 μmol/L浸泡15min。用1 μmol/L的PE預(yù)收縮后，再依次累積加入PFP(100、300、500、700、900mg/L),每隔3min加1次藥。用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定胸主動脈環(huán)張力。胸主動脈環(huán)舒張率用加入PFP后胸主動脈環(huán)舒張幅度與PE引發(fā)的最大收縮幅度之間的比值來表示，制作濃度舒張曲線。

2.4PFP對無鈣高鉀K-H液中CaCl2量效曲線的影響取12個內(nèi)皮去除胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為2組(內(nèi)皮去除對照組和內(nèi)皮去除PFP組)，每組6個胸主動脈環(huán)。將內(nèi)皮去除對照組胸主動脈環(huán)按“2.1” 項(xiàng)下方法平衡后，放入無鈣高鉀K-H液(含60mmol/L K+和100 μmol/L EGTA)預(yù)處理20min后，依次累積加入(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol/L)CaCl2，每隔3min加1次藥，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定胸主動脈環(huán)張力，得鈣離子收縮曲線。內(nèi)皮去除PFP組為加入CaCl2前用789mg/L PFP預(yù)處理10min，其他處理方法同內(nèi)皮去除對照組。

2.5PFP對胞質(zhì)內(nèi)鈣釋放誘導(dǎo)血管收縮的影響取12個內(nèi)皮去除胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為2組(內(nèi)皮去除對照組和內(nèi)皮去除PFP組)，每組6個胸主動脈環(huán)。將內(nèi)皮去除對照組大鼠的胸主動脈環(huán)按“2.1” 項(xiàng)下方法平衡后，在無鈣 K-H 液(含100 μmol/L EGTA)中平衡10min，加入PE至 1 μmol/L。內(nèi)皮去除PFP組大鼠胸主動脈環(huán)用無鈣K-H液孵育5min，用789mg/L的PFP孵育10min，加入PE 至1 μmol/L，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定PE引起的胸主動脈環(huán)張力，將內(nèi)皮去除對照組和內(nèi)皮去除PFP組張力作比較。

2.6L-NAME對PFP舒張血管的影響取12個內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為2組(內(nèi)皮完整PFP組和內(nèi)皮完整L-NAME組)，每組6個胸主動脈環(huán)。將各組大鼠的胸主動脈環(huán)按“2.1” 項(xiàng)下方法平衡后，將內(nèi)皮完整L-NAME組大鼠的胸主動脈環(huán)用100 μmol/L的N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)浸泡30min，將內(nèi)皮完整PFP組大鼠的胸主動脈環(huán)用K-H液浸泡30min，穩(wěn)定后用1 μmol/L的PE收縮至平衡后，依次累積加入PFP(100、300、500、700、900mg/L)，每隔3min加1次藥，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測定胸主動脈環(huán)張力。胸主動脈環(huán)舒張率用加入PFP后胸主動脈環(huán)舒張幅度與PE引發(fā)的最大收縮幅度之間的比值來表示，制作濃度舒張曲線。

2.7Griess法測定血管組織中NO含量取24個內(nèi)皮完整胸主動脈環(huán)，隨機(jī)分為4組：(1)內(nèi)皮完整對照組：將大鼠胸主動脈環(huán)放入K-H液中孵育6 h；(2)內(nèi)皮完整高糖組：將大鼠胸主動脈環(huán)用D-葡萄糖(44mmol/L)的K-H液孵育6 h誘導(dǎo)血管內(nèi)皮功能的損傷；(3)內(nèi)皮完整PFP組：將大鼠胸主動脈環(huán)用PFP 10mg/L的K-H液孵育6 h；(4)內(nèi)皮完整高糖+PFP組：將大鼠胸主動脈環(huán)用PFP(10mg/L)和D-葡萄糖(44mmol/L)的K-H液共同孵育6h。每組6個血管環(huán)。將各組大鼠胸主動脈環(huán)制成10%組織勻漿，4℃下2 000 r/min離心10min，吸取上清液，按96T一氧化氮試劑盒說明書測定大鼠胸主動脈的NO含量。

3　結(jié)果

3.1內(nèi)皮對PFP舒張作用的影響與內(nèi)皮去除PFP組相比，內(nèi)皮完整PFP組大鼠胸主動脈環(huán)舒張作用更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)皮完整PFP組和內(nèi)皮去除PFP組大鼠胸主動脈環(huán)最大舒張效率Emax分別為(76.24±6.59)%和(46.38±7.36)%，內(nèi)皮完整對照組和內(nèi)皮去除對照組大鼠胸主動脈環(huán)最大舒張效率Emax分別為(27.53±6.38)%和(24.42±6.63)%，見圖1。

3.2鉀通道阻斷劑對PFP舒張血管作用的影響與未經(jīng)鉀通道阻斷劑處理的內(nèi)皮去除PFP組大鼠胸主動脈環(huán)相比，用3種不同類型的鉀通道阻斷劑預(yù)處理的內(nèi)皮去除胸主動脈環(huán)，PFP舒張胸主動脈環(huán)的作用減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)皮去除PFP組Emax為(47.55±5.17)%，內(nèi)皮去除BaCl2組Emax為(10.17±4.70)%，內(nèi)皮去除Glib組Emax為(14.20±5.32)%，內(nèi)皮去除TEA組Emax為(2.43±7.32)%，見圖2。

3.3PFP對CaCl2量效曲線的影響與內(nèi)皮去除對照組比較，內(nèi)皮去除PFP組最大收縮率減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),內(nèi)皮去除對照組與內(nèi)皮去除PFP組最大收縮率分別為(46.40±4.13)%和(8.75±7.13)%，見圖3。

(注：與內(nèi)皮完整對照組比較，**P<0.01；與內(nèi)皮去除對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與內(nèi)皮去除PFP組比較，++P<0.01。)

3.4PFP對胞質(zhì)內(nèi)鈣釋放誘導(dǎo)血管收縮的影響與內(nèi)皮去除對照組比較，內(nèi)皮去除PFP組最大收縮率減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。內(nèi)皮去除對照組與內(nèi)皮去除PFP組大鼠胸主動脈環(huán)的最大收縮率分別為(65.22±8.15)%和(31.34±6.02)%，見圖4。

3.5L-NAME對PFP舒張血管作用的影響與內(nèi)皮完整PFP組比較，內(nèi)皮完整L-NAME組大鼠胸主動脈環(huán)Emax減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。內(nèi)皮完整PFP組Emax為(74.86±8.90)%，內(nèi)皮完整L-NAME組Emax為(3.83±3.57)%，見圖5。

3.6PFP對大鼠胸主動脈環(huán)中NO含量的影響與內(nèi)皮完整對照組比較，內(nèi)皮完整高糖組胸主動脈環(huán)中NO含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與內(nèi)皮完整高糖組比較，內(nèi)皮完整高糖+PFP組胸主動脈環(huán)中NO含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1　PFP和高糖對大鼠胸主動脈環(huán)中NO含量的影響

注：與內(nèi)皮完整對照組比較，**P<0.01；與高糖組比較,##P<0.01。

4　討論

血管收縮主要基于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)升高所誘發(fā)的血管平滑肌的收縮。因此影響[Ca2+]i的因素，均可影響血管收縮。內(nèi)皮去除血管收縮主要依賴平滑肌上的鉀通道和鈣通道。鉀通道的激活使K+外流，導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，使電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channels，VDCCs)的開放受到抑制從而拮抗血管收縮來舒張血管。本實(shí)驗(yàn)采用 ATP敏感鉀通道(KATP)阻斷劑Glib、鈣激活鉀通道(KCa)阻斷劑TEA、內(nèi)向整流鉀通道(Kir)阻斷劑BaCl2預(yù)處理后，均降低PFP對胸主動脈環(huán)的舒張作用，因此初步推測鉀離子通道的激活與PFP對胸主動脈環(huán)的舒張作用有關(guān)。

血管平滑肌收縮所需要的Ca2+源于胞質(zhì)內(nèi)鈣釋放和細(xì)胞外流入。外鈣內(nèi)流途徑主要通過VDCCs和受體操控性鈣通道(receptor-operated calciumchannels，ROCCs)完成[9]。細(xì)胞外高濃度的K+可引起細(xì)胞膜去極化，激活VDCCs，VDCCs的打開導(dǎo)致Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流入，導(dǎo)致血管收縮[10]。在無鈣高鉀液中，PFP處理能夠抑制CaCl2對胸主動脈環(huán)的收縮作用，推測PFP抑制了VDCCs的開放從而抑制Ca2+內(nèi)流引起的血管收縮。PE與平滑肌上的α受體結(jié)合，經(jīng)G蛋白-PLC-IP3信號途徑引發(fā)平滑肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)的Ca2+釋放，還可通過ROCCs調(diào)節(jié)[Ca2+]i，進(jìn)而增加血管張力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PFP(789mg/L)可以拮抗無鈣K-H液中PE誘導(dǎo)的胸主動脈環(huán)收縮，推測PFP舒張血管機(jī)制可能與PE誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放被抑制有關(guān)。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的舒張血管因子，內(nèi)皮細(xì)胞中NO經(jīng)由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中大鼠胸主動脈環(huán)經(jīng)一氧化氮合酶抑制劑L-NAME處理后，PFP的舒血管作用被阻斷，表明NO參與PFP對胸主動脈環(huán)的舒張作用。高糖預(yù)處理的胸主動脈環(huán)NO含量降低，經(jīng)PFP干預(yù)后，NO含量接近于對照組。高糖預(yù)處理可通過氧化應(yīng)激破壞血管內(nèi)皮功能，從而減少了NO的合成，這也是糖尿病血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)之一。PFP增加了NO的生成，提示PFP舒張血管的作用與提高NO的生成有關(guān)。Berkban等[11]的研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸能夠增加血管組織中eNOS的合成，從而緩解高血壓的發(fā)生。PFP 能夠促進(jìn)NO的生成可能亦與所含成分鞣花酸有一定的關(guān)系。

綜上所述，PFP舒張血管的作用與促進(jìn)NO合成，激活平滑肌上的鉀通道以及抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和胞質(zhì)內(nèi)Ca2+釋放有關(guān)。但其詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。

[收稿日期：2018-01-26]

(本文編輯施洋)