孫玉云，張 健，鄭營營，顧丙新，羅建民，張建平，徐俊彥，章英劍，王明偉

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，復旦大學生物醫(yī)學影像研究中心，上海分子影像探針工程技術研究中心，上海 200032；

2.復旦大學核物理與離子束應用教育部重點實驗室，上海 200433；

3.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234

最新統(tǒng)計顯示，我國腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）發(fā)病率位居泌尿系統(tǒng)腫瘤第3位，高達6.8/10萬［1］，且和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)相比，其發(fā)病率在經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)明顯較高［2］。18F-FDG作為臨床最常規(guī)和廣泛使用的PET/CT顯像劑，其PET/CT顯像診斷腎細胞癌的靈敏度僅有47%～60%，可能是由于葡萄糖代謝并非腎癌的主要代謝方式。有研究提出，腎細胞癌脂肪酸代謝異常增高，并且以脂肪酸從頭合成為主［3］。近來有研究報道［4-6］，11C-乙酸（11C-acetate，11C-AC）作為一種小分子脂肪酸，其PET/CT顯像可用于診斷腎細胞癌，能彌補18F-FDG PET/CT顯像在腎癌診斷方面的不足。然而，由于11C半衰期很短（t1/2=20.4 min），極大地限制了11C-AC PET/CT顯像在臨床中的廣泛應用。因此，近年來18F標記乙酸鹽（18F-fluoroacetate，18F-FAC）的研究開始出現(xiàn)［7-8］。18F-FAC作為11C-AC類似物，并且18F具有較長的半衰期（t1/2=109.7 min），其PET/CT顯像具有很大的應用前景。例如，最新的一項研究顯示，18F-FAC PET/CT對低級別腎癌的檢出率為82.6%，顯著高于18F-FDG顯像的8.7%［8］。然而，截至到目前，尚沒有18F-FAC PET/CT分子影像在體監(jiān)測腎癌脂肪酸代謝動態(tài)變化的研究，因而也不清楚腎細胞癌攝取18F-FAC與脂肪酸代謝之間的關系。我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，腎細胞癌攝取11C-AC與脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）有關［4］，而FAS正是脂肪酸從頭合成途徑的關鍵酶之一。多項基礎研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR為FAS的上游調(diào)控因子之一［9-11］，因此抑制該信號轉導途徑可以抑制FAS基因和蛋白的表達［12］。在本項研究中，我們選用mTOR抑制劑依維莫司作為干預藥物，在藥物處理前后的多個時間點，開展腎癌模型鼠的縱向性在體18F-FAC PET/CT顯像，對比觀察腎癌18F-FAC攝取和FAS表達的變化，從而探討腫瘤18F-FAC攝取量與FAS表達量的相關性并研究18F-FAC PET/CT能否在體監(jiān)測腎癌脂肪酸代謝變化。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑和儀器

18F-FAC由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科自制，合成方法見參考文獻 ［13］。依維莫司購自大連美侖生物技術有限公司，于-20 ℃冰箱中保存，臨用時取適量該藥物溶于30%丙二醇（先溶解），再加入5%Tween 80及去離子水，使藥物濃度為2 mg/mL。兔抗人FAS抗體購自英國Abcam公司，使用時按1∶100配比。Inveon小動物PET/CT儀器為復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學科擁有。

1.2 腎癌細胞培養(yǎng)與腫瘤模型

將人腎透明細胞癌ACHN加入DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中溫育。取對數(shù)期生長的ACHN細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入10.0 mL PBS，以1 000 r/min，離心3 次，每次5 min。重新加入PBS制成細胞懸液，等待接種。

50只BALB/c裸小鼠（6周齡，雌性）購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，于右側大腿皮下接種1×107個ACHN細胞，在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)20～30 d成瘤，待腫瘤直徑達到5 mm時開始進行實驗。

1.3 實驗設計

荷瘤鼠分為3組，分別為18F-FAC microPET/CT顯像組（n=6）、免疫組織化學組（n=24）和生存期觀察組（n=20）。其中每組又分為2個亞組，即實驗組和對照組（圖1），實驗組每天給予依維莫司（10 mg/kg），連續(xù)給藥14 d，對照組每天給予等體積的0.9%NaCl溶液。

圖1 18F-FAC microPET/CT顯像組、免疫組織化學組和生存期觀察組實驗設計示意圖Fig1 Experimental design for longitudinal 18F-FAC microPET/CT imaging, immunohistochemistry staining and treatment protocols

18F-FAC microPET/CT顯像實驗中，實驗組和對照組各3只ACHN荷瘤鼠，分別在第0（干預前）天和干預后第5、10和15天行18F-FAC microPET/CT顯像。免疫組織化學實驗中，實驗組和對照組各12只ACHN荷瘤鼠，分別在第0、5、10和15天隨機處死3只荷瘤裸鼠，獲取腫瘤組織，進行FAS免疫組織化學染色。生存期實驗中，實驗組和對照組各10只ACHN荷瘤鼠，每隔1 d測量、記錄荷瘤鼠腫瘤直徑，依據(jù)公式V=a×b2/2計算腫瘤體積（長徑記為a，短徑記為b），同時觀察荷瘤鼠死亡時間，記錄、繪制生存期曲線。

1.4 18F-FAC microPET/CT顯像

荷瘤鼠于第0、5、10和15天，經(jīng)尾靜脈注射7.3～9.2 MBq（200～250 μCi）18F-FAC，注射后2 h采集10 min靜態(tài)PET圖像和CT圖像。利用儀器的工作軟件Inveon Research Workshop，通過OSEM3D/MAP法重建，獲得經(jīng)過衰減校正后的PET/CT圖像，在腫瘤部位及對側大腿肌肉部位勾畫感興趣區(qū)（region of interest，ROI），測定每克組織放射性占注入量的百分比最大值（the maximum of the percent injected dose per gram tissue，%ID/gmax），并計算出靶本比（T/M）。

1.5 FAS免疫組織化學染色及分析

分別于第0、5、10和15天處死3只荷瘤鼠，剝離獲取腫瘤組織。然后，將瘤塊置于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，脫蠟，抗原修復；加入一抗（兔抗人FAS抗體，1∶100），4 ℃溫育過夜；再加入HRP-山羊抗兔/鼠通用二抗（DAKO）及DAB顯色劑；最后脫水封片，并顯微鏡檢，圖像采集分析（×200）。FAS陽性率=陽性區(qū)域光密度值（integral optical density，IOD）/視野面積（mm2）。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。所有定量數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用獨立t檢驗。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗比較ACHN荷瘤鼠生存差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 18F-FAC PET/CT顯像在體監(jiān)測腎癌脂肪酸代謝隨時間的動態(tài)變化

圖2A是實驗組和對照組腎癌模型在第0（基線）、5、10和15天的靜態(tài)18F-FAC PET/CT圖像，圖2B和2C是對應的腫瘤組織18F-FAC攝取值%ID/gmax及其與對側肌肉攝取值的比值（T/M）隨時間定量變化關系圖。對照組腎癌攝取18F-FAC隨著時間明顯升高，第5、10和15天的%ID/gmax分別為10.560±0.677、12.325±0.275和13.450±0.517，與基線值8.425±0.549相比差異均有統(tǒng)計學意義［P＜0.05（第5天），P＜0.01（第10和15天），圖2A、B］。實驗組腎癌組織攝取18F-FAC也隨時間不斷增加，但與對照組相比明顯趨緩。第5、10和15天%ID/gmax分別為9.708±0.792、10.285±0.751和10.859±1.100，與基線值8.087 ± 0.792相比差異也均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。進一步組間比較分析發(fā)現(xiàn)，基線時兩組腫瘤組織的18F-FAC攝取值基本相當，差異無統(tǒng)計學意義；而在之后的時間點實驗組攝取值均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義［P＜0.01（第5天），P＜0.05（第10和15天）］。本研究又采用T/M值分析腎癌的18F-FAC攝取變化，獲得類似的結果，即除基線值相當外，實驗組T/M均顯著低于對照組，且各時間點差異均有統(tǒng)計學意義［P＜0.01（第5和10天），P＜0.001（第15天），圖2C］。18F-FAC PET/CT顯像實驗結果說明，腎癌攝取18F-FAC隨時間及干預處理呈動態(tài)變化，且和對照組比較，依維莫司的干預可以降低腎癌的脂肪酸代謝。

圖2 18F-FAC小動物PET/CT顯像及定量分析Fig2 18F-FAC microPET/CT imaging and the quantitative analysis

2.2 腎癌FAS表達的變化

圖3A為腎癌組織的FAS免疫組織化學染色圖像，其陽性表現(xiàn)為棕色的細胞質染色，圖3B為對應的FAS表達水平的定量計算。結果顯示，對照組腎癌組織FAS表達水平隨時間推移明顯升高，第5、10和15天的IOD/mm2分別為0.073±0.003、0.117±0.002和0.213±0.017，與基線值0.032±0.003相比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。實驗組腎癌組織FAS表達程度隨時間推移也在不斷增加，但與對照組相比明顯趨緩，第5、10和15天IOD/mm2分別為0.037±0.001、0.074±0.001和0.106±0.012，與基線值0.032±0.000相比差異也均有統(tǒng)計學意義［P＜0.01（第5天），P＜0.001（第10天），P＜0.05（第15天）］。進一步組間對比發(fā)現(xiàn)，基線時兩組腫瘤組織的FAS的表達水平基本相當，差異無統(tǒng)計學意義；而在之后的時間點實驗組FAS表達均明顯低于對照組，然而第5天的差異無統(tǒng)計學意義，第10和15天的差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。免疫組織化學實驗結果顯示，腎癌FAS表達水平隨時間及干預處理呈動態(tài)變化，與上述18F-FAC變化趨勢一致，且和對照組比較，依維莫司干預可降低腎癌的FAS表達程度。

圖3 FAS免疫組織化學染色及定量分析Fig3 IHC staining of FAS and the quantitative analysis

2.3 腎癌18F-FAC攝取與FAS表達的相關性

圖4為腎癌18F-FAC攝取與FAS表達的相關性關系圖。腎癌18F-FAC攝?。?ID/gmax）（圖4A）和T/M（圖4B）均與FAS表達具有良好的正向相關性（P均＜0.001）。該實驗結果進一步說明，18F-FAC攝取與FAS表達具有一致的變化趨勢，即FAS表達升高，18F-FAC攝取增加，反之亦然。

2.4 依維莫司處理明顯抑制腫瘤體積增長和延長荷瘤鼠的生存期

我們進一步開展了腫瘤體積變化和生存期實驗，以觀察依維莫司干預腎癌引起的抗腫瘤效應。實驗組腫瘤生長緩慢，而對照組的腫瘤生長迅速，其腫瘤體積顯著增大，并且兩者的體積在第9天開始差異有統(tǒng)計學意義(圖5A)。實驗組荷瘤鼠的中位生存期為35 d，而對照組僅為23 d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖5B）。該實驗結果表明，依維莫司可抑制腎癌生長，延長ACHN荷瘤鼠中位生存期。

圖5 依維莫司處理對腫瘤體積（A）和荷瘤鼠生存期（B）的影響Fig5 Effect of everolimus on tumor volume (A) and the survival (B) of ACHN tumor-bearing mice

3 討 論

核素11C和18F等標記的11C-AC和18F-FAC在腎癌PET/CT顯像方面具有重要的作用。自1995年Shreve等［14］首次將11C-AC用于腎臟腫瘤PET顯像以來，11C-AC PET/CT在腎臟腫瘤的臨床應用越來越多，認為其腎癌診斷的靈敏度明顯高于18F-FDG［15-17］。近年來，有研究顯示，18F-FAC PET/CT對腎癌亦有較高的診斷效能［6］。然而，到目前為止，還未見到18F-FAC PET/CT分子影像在體監(jiān)測腎癌脂肪酸代謝的動態(tài)變化的報道，因而也不清楚腎癌攝取18F-FAC與脂肪酸代謝及FAS之間的關系。

本實驗首先選擇mTOR抑制劑依維莫司作為干預藥物，將腎癌模型分為實驗組和對照組，在藥物干預前后的不同時間點，開展縱向性在體18F-FAC PET/CT顯像和FAS免疫組織化學實驗，以觀察18F-FAC攝取與FAS表達的動態(tài)變化。目前，常見的有效抑制FAS表達的藥物為蘇氨酸和C75，然而，兩者都會影響患者營養(yǎng)物質攝取，減輕體質量［18］，這些因素阻礙了它們的臨床應用。另外，根據(jù)本課題組前期研究經(jīng)驗，抑制劑量的C75容易導致實驗鼠死亡。依維莫司是一種mTOR抑制劑，臨床上已用于腎癌的二線治療，同時已有研究提出PI3K/AKT/mTOR是FAS上游通路［19］，可通過抑制mTOR從而抑制FAS基因及蛋白的表達，因此我們選擇依維莫司作為建模干預藥物。需要指出的是，為了確保實驗結果不受干擾，我們設置了3個獨立實驗組，分別進行18F-FAC顯像實驗、FAS免疫組織化學實驗及生存期觀察實驗。鑒于荷CWR22乳腺癌小鼠的18F-FAC PET/CT研究發(fā)現(xiàn)，在注射后2 h腫瘤與肌肉攝取的T/M比1 h高［20］，因此，我們選擇注射18F-FAC后2 h開展PET/CT顯像。在體小動物microPET/CT顯像結果表明，實驗組腎癌18F-FAC攝取明顯低于對照組。相應的免疫組織化學結果發(fā)現(xiàn)，實驗組腫瘤組織FAS表達也均顯著低于對照組。Yan等［19］采用另一種mTOR抑制劑雷帕霉素同樣降低了乳腺癌細胞FAS蛋白表達，與該研究結果類似。

綜合18F-FAC PET/CT顯像和FAS免疫組織化學實驗可見，腎癌攝取18F-FAC和FAS表達均隨時間呈現(xiàn)出動態(tài)增加的變化趨勢，而實驗組的增加幅度明顯小于對照組。Pflug等［21］通過對轉基因前列腺癌小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠周齡增加及疾病進展，F(xiàn)AS表達呈明顯上升趨勢。本實驗也觀察到對照組腫瘤FAS表達隨時間推移不斷上升。有研究表明，腫瘤負荷越高，F(xiàn)AS表達也越高［22-23］，因此，本實驗中腎癌FAS表達水平隨時間推移而升高的可能原因是腫瘤負荷在不斷增加，脂肪酸代謝越來越旺盛。且第5天對照組腎癌FAS表達水平明顯高于基線值（2.2倍），這與前期研究結果一致［24-25］。Furuta等［24］在乏氧和存在活性氧自由基環(huán)境中（模擬腫瘤微環(huán)境），培養(yǎng)乳腺癌細胞，F(xiàn)AS基因及蛋白表達明顯上調(diào)。其中在氧自由基存在條件下，12 h后MDA-MB-157乳腺癌細胞FAS mRNA表達水平增加約3倍。Lee等［25］發(fā)現(xiàn)在乏氧環(huán)境下，24 h后UCB-hMSC干細胞FAS表達增加2倍。此外，依維莫司處理期間FAS表達仍然緩慢增加，可能原因是抑制FAS并非依維莫司的主要藥理作用［26］，F(xiàn)AS表達也可能受其他多種因素調(diào)節(jié)，如乙酰轉移酶P300［27］。進一步的相關性分析發(fā)現(xiàn)，腎癌組織18F-FAC攝取與FAS表達程度之間呈顯著正相關。這些都說明兩者具有一致的變化趨勢，即FAS表達升高，18F-FAC攝取增加，反之亦然。

我們繼續(xù)開展了腫瘤體積變化和生存期實驗，以觀察依維莫司處理腎癌引起的抗腫瘤效應。實驗組腫瘤體積較對照組明顯縮小，生存期則明顯延長。由此可見，依維莫司既能降低腎癌脂肪酸代謝和FAS表達，又具有明顯抑制腎癌生長的作用。

本實驗室的前期研究已經(jīng)評估了18F-FAC人體器官的內(nèi)照射劑量［28］，結果顯示，全身有效劑量低于國際輻射防護委員會（International Commission on Radiological Protection，ICRP）發(fā)布的ICRP 118號報告［29］中關于個人每年最高有效劑量限值。其他研究也證明了18F-FAC的安全性，適合于人體顯像［30］。由此可見，18F-FAC是安全有效的PET顯像劑，其PET/CT顯像在臨床應用中將有廣闊的前景。

綜上所述，我們開展了縱向性、多時間點的在體腎癌18F-FAC PET/CT分子影像學研究，發(fā)現(xiàn)了腎癌攝取18F-FAC的動態(tài)變化與FAS表達的變化趨勢一致，并且二者具有良好的正向相關性。因此，本研究認為18F-FAC PET/CT顯像可用于在體監(jiān)測腎癌脂肪酸代謝動態(tài)變化，也有望用于靶向抗脂肪酸代謝藥物的療效評價。

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