彭雪強(qiáng)，楊 良，張小東，馬英博，楊 朔，李 巖，魏士博，范 慶，華向東，劉金鋼，李航宇

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普外科，遼寧 沈陽 110032；

2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院肝膽外科，遼寧 沈陽 110042

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的消化道惡性腫瘤，最新癌癥統(tǒng)計(jì)顯示，HCC已成為世界各地癌癥患者死亡的主要原因之一［1］。我國2012年共發(fā)生78 200例新HCC病例和745 500例死亡病例，約占全球新發(fā)患者和死亡人數(shù)的50%［1］。當(dāng)前HCC的治療主要分為手術(shù)和非手術(shù)治療，但是由于其惡性程度高、術(shù)后易復(fù)發(fā)等原因，HCC的治療仍然是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)［2］，因此進(jìn)一步探討其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，將有助于HCC患者的早期診斷與靶向治療。自噬是真核生物廣泛進(jìn)行的維持自身穩(wěn)態(tài)的機(jī)制，又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［3］。一方面，自噬可以將真核生物細(xì)胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)和損傷的細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解，從而抑制癌癥發(fā)生［4］。另一方面，自噬可以提供腫瘤細(xì)胞在低氧、營養(yǎng)不足時(shí)的能量供應(yīng)，有利于腫瘤惡性進(jìn)程［5］。總之自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有直接的關(guān)系［4-6］。

當(dāng)前研究表明，酵母中存在超過30種自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene，Atg），在哺乳動(dòng)物中也已鑒定出16個(gè)Atg［7］。自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，Atg5）是自噬小體形成中泛素樣連接系統(tǒng)Atgl2-Atg5-Atgl6的關(guān)鍵因子，已被證明是自噬體形成所必需的［8-9］。但是，目前關(guān)于HCC中Atg5的表達(dá)情況尚不明確。因此本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Atg5蛋白在HCC和癌旁組織中的表達(dá)，并結(jié)合其表達(dá)水平，分析與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。同時(shí)采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）分別檢測(cè)HCC及癌旁組織中Atg5蛋白和mRNA的表達(dá)。探究在HCC發(fā)生、發(fā)展中Atg5表達(dá)的改變與意義，為HCC的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集和研究對(duì)象

采用中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2015年3月—2017年6月進(jìn)行HCC手術(shù)切除的110例HCC標(biāo)本。所有組織經(jīng)兩名病理學(xué)醫(yī)師評(píng)估確診為HCC并復(fù)查無誤。患者術(shù)前未進(jìn)行化療和放療，且具有完整的臨床、病理和隨訪資料。其中男性89例，女性21例；年齡34～83歲，中位年齡55歲，小于50歲48例，大于等于50歲62例；HBsAg陰性25例，HBsAg陽性85例；腫瘤直徑小于5 cm 69例，大于等于5 cm 41例；未發(fā)現(xiàn)肝硬化24例，肝硬化86例；低分化67例，中、高分化43例；甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平小于200 ng/mL 42例，大于等于200 ng/mL 68例；未發(fā)現(xiàn)有血管侵犯66例，合并血管侵犯44例。對(duì)照組取樣距離癌組織大于2 cm。另外46例是在手術(shù)時(shí)立即取材的新鮮HCC及癌旁組織標(biāo)本，置液氮中保存。其中男性34例，女性12例；年齡37～80歲，中位年齡57歲，小于50歲16例，大于等于50歲30例；HBsAg陰性11例，HBsAg陽性35例；腫瘤直徑小于5 cm 28例，大于等于5 cm 18例；未發(fā)現(xiàn)肝硬化14例，肝硬化32例；低分化16例，中、高分化30例；AFP水平小于200 ng/mL 19例，大于等于200 ng/mL 27例；未發(fā)現(xiàn)有血管侵犯31例，合并血管侵犯15例。標(biāo)本檢測(cè)均在患者和其家屬同意，并簽署知情同意書的情況下進(jìn)行。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，兔抗人Atg5多克隆抗體購自美國AbSci公司，鼠抗人多克隆β-actin抗體購自美國ABclonal公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，RTFQ-PCR試劑盒購自美國Promega公司，PCR引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)染色法半定量分析110例HCC及癌旁組織中Atg5蛋白的表達(dá)。其具體操作步驟根據(jù)說明書指導(dǎo)完成，同時(shí)用試劑盒提供的陽性切片作為對(duì)照，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒染色判定為陽性，每張切片在高倍鏡下取3個(gè)不同視野，并各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。染色陽性細(xì)胞比例計(jì)分：陽性細(xì)胞比例≤10%，計(jì)0分；10%＜陽性細(xì)胞比例≤25%，計(jì)1分；25%＜陽性細(xì)胞比例≤50%，計(jì)2分；陽性細(xì)胞比例＞50%，計(jì)3分。細(xì)胞染色強(qiáng)度強(qiáng)弱：無明顯染色計(jì)0分，染色淺黃色計(jì)1分，染色棕黃色計(jì)2分，染色棕褐色計(jì)3分。染色陽性細(xì)胞比例計(jì)分與染色強(qiáng)度強(qiáng)弱相乘即為免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度計(jì)分，0～1分為（-），2～3分為（+），3～4分為（++），＞4分為（+++）。結(jié)果，計(jì)分≥2為陽性，計(jì)分≤1為陰性［10］。

1.4 Western blot檢測(cè)

采用Western blot檢測(cè)46例HCC及癌旁組織中Atg5蛋白的表達(dá)，其具體操作步驟根據(jù)說明書指導(dǎo)完成。通過Image J軟件分析圖像，Atg5的表達(dá)經(jīng)β-actin內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后求得其相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 RTFQ-PCR檢測(cè)

采用RTFQ-PCR檢測(cè)46例新鮮HCC及癌旁組織中Atg5 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。取1 mm3組織剪碎研磨后，加入1 mL TRIzol溶液裂解后經(jīng)氯仿等提取細(xì)胞總R NA，測(cè)定RNA的純度和濃度，其比值為1.8～2.0，mRNA的純度較高。DNA的合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。PCR Atg5引物序列：上游引物序列為5’-GCAACTCTGGATGGGATTGC-3’，下游引物序列為5’-TTGCAGCAGCGAAGTGTTTC-3’；G A P D H引物序列：上游引物序列為5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游引物序列為5’-GCGCCCAATACGACCAAATC-3’。根據(jù)SYBR Green說明書配制RTFQ-PCR的反應(yīng)體系。RTFQ-PCR的循環(huán)條件：95 ℃變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃ 25 s退火，共40個(gè)循環(huán)。由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到Atg5 mRNA表達(dá)的相對(duì)濃度，并以Atg5與GAPDH基因相對(duì)濃度的比值去反映其相對(duì)的表達(dá)量。每例設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的統(tǒng)計(jì)分析用χ2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 HCC和癌旁組織中Atg5的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，Atg5主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，染色呈現(xiàn)棕黃色。其在HCC組織中的表達(dá)，（-）31例，（+）26例，（++）30例，（+++）23例，總表達(dá)陽性率為71.82%（79/110）；其在癌旁組織中的表達(dá)，（-）87例，（+）21例，（++）2例，（+++）0例，總表達(dá)陽性率為20.09%（23/110），詳見圖1。

圖1 HCC和癌旁組織中Atg5蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.1 The immunohistochemical staining results of Atg5 protein in HCC and adjacent tissues

2.1.2 HCC組織中Atg5蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

HCC組織中Atg5蛋白的表達(dá)與患者性別、年齡、HBsAg陽性、肝硬化及腫瘤分化程度均無關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤直徑、AFP水平及血管侵犯相關(guān)（P＜0.05），腫瘤直徑大于等于5 cm、AFP水平大于等于200 ng/mL及合并血管侵犯肝癌患者的Atg5蛋白的表達(dá)陽性率較高（表1）。

表1 HCC組織中Atg5蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Expression of Atg5 protein in HCC tissue and its relationship with clinicopathological features

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Atg5蛋白表達(dá)水平，Western blot結(jié)果顯示，46例HCC組織中Atg5蛋白的表達(dá)水平為1.25±0.25，癌旁組織為0.47±0.12。Atg5蛋白在HCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織（P＜0.05，圖2）。

2.3 RTFQ-PCR結(jié)果

RTFQ-PCR結(jié)果表明，Atg5 mRNA在46例HCC組織中的相對(duì)表達(dá)水平為10.87±0.513，在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平為2.498±0.175。Atg5 mRNA在HCC組織中的表達(dá)是癌旁組織的4.37倍（P＜0.05，圖3）。

圖 2 Western blot檢測(cè)Atg5蛋白在HCC和癌旁組織中的表達(dá)Fig. 2 The expression of Atg5 protein in HCC and adjacent tissues detected by Western blot

圖3 RTFQ-PCR Atg5 mRNA在HCC和癌旁組織中的表達(dá)Fig.3 The expression of Atg5 mRNA in HCC and adjacent tissues detected by RTFQ-PCR

3 討 論

自噬過程的發(fā)生離不開自噬小體的形成［11］。有研究證實(shí)，在自噬小體形成中Atg起主要的調(diào)控作用［12］。其在分子機(jī)制上主要主導(dǎo)二類泛素結(jié)合系統(tǒng)，分別是Atgl2-Atg5-Atgl6共軛系統(tǒng)和Atg8/LC3共軛系統(tǒng)，此外，Atg12-Atg5-Atg16共軛系統(tǒng)可能在自噬體生成期間驅(qū)動(dòng)膜小葉的擴(kuò)張和形成［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，Atg12-Atg5-Atg16共軛系統(tǒng)主要位于吞噬泡的外側(cè)，在自噬體形成之后會(huì)自發(fā)釋放到細(xì)胞質(zhì)中［13］。其中Atg5基因映射到染色體位點(diǎn)6q21，Atg5在Atgl2-Atg5-Atgl6復(fù)合物中起關(guān)鍵作用，并且許多蛋白質(zhì)與Atg5直接相互作用，常在自噬體成熟中起關(guān)鍵角色［13-14］，因而成為自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

同時(shí)，當(dāng)前研究表明，Atg5基因的突變與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)［7,14-16］。目前已有研究報(bào)道胃癌和前列腺癌中Atg5表達(dá)上調(diào)，且促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9,17-18］，并且在關(guān)于胃癌的研究中證實(shí)，3,3’-二吲哚基甲烷可能通過miR-30e-ATG5調(diào)節(jié)自噬抑制胃癌細(xì)胞的增殖［19］。但是在上皮性卵巢癌［20］、結(jié)直腸癌［7］中Atg5的表達(dá)下調(diào)并促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在早期皮膚黑色素瘤中Atg5對(duì)HCC的增殖具有明顯抑制作用［21］。此外研究顯示，Atg5的敲除會(huì)誘發(fā)實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生［15］，在大鼠早期HCC中敲除Atg5同樣有促癌作用［22］，同時(shí)也有研究證實(shí)，在沉默NIH3T3細(xì)胞系A(chǔ)tg5基因后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變，并促進(jìn)其侵襲能力［16］。miR-181a可以通過靶向下調(diào)HepG2細(xì)胞Atg5抑制自噬的活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［23］。但也有研究證實(shí)，在褪黑素處理HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，Atg5的敲除阻斷自噬，會(huì)顯著促進(jìn)褪黑素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡［24］?？傊?，目前的研究表明，Atg5在不同的腫瘤中表達(dá)趨勢(shì)并不相同，可能由于自噬的發(fā)生是涉及多種自噬相關(guān)基因的復(fù)雜過程。而且在肝癌細(xì)胞中Atg5下調(diào)后，自噬受到抑制的情況下，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可出現(xiàn)抑制或促進(jìn)的不同結(jié)果［23-24］。自噬對(duì)HCC發(fā)生、發(fā)展的影響目前仍存在爭(zhēng)議，這可能是由于自噬在HCC的發(fā)生、發(fā)展中的雙重調(diào)控作用，即在腫瘤發(fā)生早期起到腫瘤抑制因子的作用，但當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生惡變后，自噬的發(fā)生將有利于HCC細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下存活，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展［25］。綜上所述，目前關(guān)于HCC中Atg5的表達(dá)及其對(duì)于HCC的發(fā)生、發(fā)展的確切意義仍不明確。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HCC及癌旁組織中Atg5蛋白的表達(dá)，證實(shí)肝癌組織中Atg5蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，HCC組織中Atg5蛋白上調(diào)。其次通過Atg5的表達(dá)與臨床病理參數(shù)分析可知，Atg5的表達(dá)與腫瘤直徑、AFP水平及血管侵犯相關(guān)（P＜0.05）。且腫瘤直徑大于等于5 cm、AFP水平大于等于200 ng/mL及合并血管侵犯者Atg5蛋白的表達(dá)陽性率高。同時(shí)采用Western blot與RTFQ-PCR分別驗(yàn)證癌旁及HCC組織中Atg5蛋白和mRNA的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，相比于癌旁組織，HCC組織中Atg5基因在轉(zhuǎn)錄與翻譯兩個(gè)水平上都出現(xiàn)上調(diào)（P＜0.05）。

綜上所述，HCC的發(fā)生、發(fā)展與Atg5蛋白的表達(dá)上調(diào)密切相關(guān)，Atg5可能成為HCC治療的潛在靶點(diǎn)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］ TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics, 2012 ［J］. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87-108.

［2］ YEGIN E G, OYMACI E, KARATAY E, et al. Progress in surgical and nonsurgical approaches for hepatocellular carcinoma treatment ［J］. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2016, 15(3): 234-256.

［3］ PARZYCH K R, KLIONSKY D J. An overview of autophagy:morphology, mechanism, and regulation ［J］. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(3): 460-473.

［4］ WHITE E. The role for autophagy in cancer ［J］. J Clin Invest, 2015, 125(1): 42-46.

［5］ WHITE E, MEHNERT J M, CHAN C S. Autophagy, metabolism,and cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2015, 21(22): 5037-5046.

［6］ GALBRAITH I I, DUGGAN G. Envelope-function matching conditions for GaAs/(Al,Ga)As heterojunctions ［J］. Phys Rev B Condens Matter, 1988, 38(14): 10057-10059.

［7］ CHO D H, JO Y K, KIM S C, et al. Down-regulated expression of ATG5 in colorectal cancer［J］. Anticancer Res, 2012,32(9): 4091-4096.

［8］ WALCZAK M, MARTENS S. Dissecting the role of the Atg12-Atg5-Atg16 complex during autophagosome formation ［J］.Autophagy, 2013, 9(3): 424-425.

［9］ LI X, LI C, ZHU L H. Correlation of autophagy-associated gene Atg5 with tumorigenesis of prostate cancer ［J］. Zhonghua Nan Ke Xue, 2015, 21(1): 31-34.

［10］ 邢傳平, 劉 斌, 董 亮. 免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果的判斷方法 ［J］. 中華病理學(xué)雜志, 2001, 30(4): 318-318.

［11］ YANG Z, KLIONSKY D J. An overview of the molecular mechanism of autophagy ［J］. Curr Top Microbiol Immunol,2009, 335: 1-32.

［12］ SUZUKI K, AKIOKA M, KONDO-KAKUTA C, et al. Fine mapping of autophagy-related proteins during autophagosome formation in Saccharomyces cerevisiae ［J］. J Cell Sci, 2013,126(Pt 11): 2534-2544.

［13］ ROGOV V, DOTSCH V, JOHANSEN T, et al. Interactions between autophagy receptors and ubiquitin-like proteins form the molecular basis for selective autophagy［J］. Mol Cell,2014, 53(2): 167-178.

［14］ KIM J H, HONG S B, LEE J K, et al. Insights into autophagosome maturation revealed by the structures of ATG5 with its interacting partners ［J］. Autophagy, 2015, 11(1): 75-87.

［15］ LIU H, HE Z, SIMON H U. Protective role of autophagy and autophagy-related protein 5 in early tumorigenesis ［J］. J Mol Med (Berl), 2015, 93(2): 159-164.

［16］ HWANG S H, HAN B I, LEE M. Knockout of ATG5 leads to malignant cell transformation and resistance to Src family kinase inhibitor PP2 ［J］. J Cell Physiol, 2018, 233(1): 506-515.

［17］ 李 新, 李 佽, 朱璐宏, 等. 自噬相關(guān)基因Atg5與前列腺腺癌發(fā)生的相關(guān)性分析 ［J］. 中華男科學(xué)雜志, 2015, 21(1):31-34.

［18］ CAO Q H, LIU F, YANG Z L, et al. Prognostic value of autophagy related proteins ULK1, Beclin 1, ATG3, ATG5,ATG7, ATG9, ATG10, ATG12, LC3B and p62/SQSTM1 in gastric cancer ［J］. Am J Transl Res, 2016, 8(9): 3831-3847.

［19］ YE Y, FANG Y, XU W, et al. 3,3’-Diindolylmethane induces anti-human gastric cancer cells by the miR-30e-ATG5 modulating autophagy ［J］. Biochem Pharmacol, 2016, 115:77-84.

［20］ 鄧琦程, 王福萍, 高愛華, 等. Beclin1和Atg5在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義 ［J］. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2013,33(12): 1595-1599.

［21］ LIU H, HE Z, VON RUTTE T, et al. Down-regulation of autophagy-related protein 5 (ATG5) contributes to the pathogenesis of early-stage cutaneous melanoma ［J］. Sci Transl Med, 2013, 5(202): 202ra123.

［22］ SUN K, XU L, JING Y, et al. Autophagy-deficient Kupffer cells promote tumorigenesis by enhancing mtROS-NF-kappaBIL1alpha/beta-dependent inflammation and fibrosis during the preneoplastic stage of hepatocarcinogenesis ［J］. Cancer Lett,2017, 388: 198-207.

［23］ ANG J, HE Y, ZHAI N, et al. MicroRNA-181a inhibits autophagy by targeting Atg5 in hepatocellular carcinoma ［J］.Front Biosci (Landmark Ed), 2018, 23: 388-396.

［24］ RDONEZ R, FERNANDEZ A, PRIETO-DOMINGUEZ N, et al. Ceramide metabolism regulates autophagy and apoptotic cell death induced by melatonin in liver cancer cells ［J］. J Pineal Res, 2015, 59(2): 178-189.

［25］ IU L, LIAO J Z, HE X X, et al. The role of autophagy in hepatocellular carcinoma: friend or foe ［J］. Oncotarget, 2017,8(34): 57707-57722.