盧洪勝 曹學全 包衛(wèi)光 章輝 周璐青 於櫻枝

胃癌是全球發(fā)病率第5位的惡性腫瘤，在腫瘤死亡率中居第3位[1]。由于晚期胃癌患者復發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，且缺乏有效的治療策略，因此預后較差[2]。此外，胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制仍不清楚。因此，識別新的轉(zhuǎn)移相關基因和闡述其潛在的機制可能為抗癌治療提供潛在的靶點。MYBL2基因，也被稱為B-myb，是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在所有增殖細胞中廣泛表達[3]。MYBL2在細胞周期進展、細胞存活和細胞分化過程中起作用，提示MYBL2失調(diào)可能具有致癌潛能。MYBL2在乳腺癌、大腸癌和食管癌等多種實體癌中過表達，且與患者預后不良有關[4-6]。研究證實，MYBL2在p53基因突變的腫瘤中不成比例的上調(diào)，甚至在p53突變的細胞中可以克服DNA損傷誘導G2期阻滯[7]。目前胃癌組織中MYBL2和p53蛋白聯(lián)合表達的臨床意義研究鮮見報道。本研究采用組織芯片結合免疫組化En Vision法檢測88例胃癌和相應癌旁組織中MYBL2和p53蛋白的表達差異，分析MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系，以及胃癌組織中MYBL2和p53蛋白表達的相關性，初步探討MYBL2和p53蛋白異常表達在胃癌發(fā)生、進展中的臨床意義及兩者之間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2013年1月至2017年7月間行根治手術的88例胃癌切除標本，均具有完整的臨床病理資料，患者術前均未接受放射和化學治療，術后均經(jīng)病理證實。腫瘤組織均取自腫瘤中心非壞死部分，同時取距離腫瘤＞5cm相應的癌旁正常黏膜組織作為對照。88例胃癌患者中男58例，女30例，年齡32~78（66.26±12.35）歲。組織學分級：高分化9例，中分化30例，低分化49例。根據(jù)2016年國際抗癌聯(lián)盟第8版TNM分期標準：I期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ52例，Ⅳ期1例。浸潤深度（T分期）：T19例，T212例，T32例，T465例；淋巴結轉(zhuǎn)移情況（N分期）：N019例，N114例，N221例，N334例。所有組織標本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。

1.2 主要試劑 鼠抗人MYBL2單克隆抗體購自美國Abnova公司，鼠抗人p53單克隆抗體購自美國Sigma公司，即用型羊抗鼠免疫組化En VisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 組織芯片的制作 對所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后HE染色，由2位病理科副主任醫(yī)師進行診斷，并在顯微鏡下找到典型病變部位作標記。利用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打直徑1mm的孔，根據(jù)HE切片上標記的病變部位，然后在供體組織蠟塊上的對應位置獲取同樣大小直徑的組織芯，插入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號，重復上述步驟制成陣列塊，以4~5μm厚度連續(xù)切片，分別進行HE及免疫組化染色。所得組織芯片的每個點均經(jīng)過病理診斷。

1.4 免疫組化染色 采用En Vision二步法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復，3%BSA封閉，一抗（MYBL2 工作濃度 1：200；p53 工作濃度 1：100）4℃過夜，DAB顯色，封片后光鏡下觀察。以PBS液代替一抗做陰性對照。

1.5 結果判定 免疫組化染色出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒為陽性。MYBL2陽性表達位于細胞質(zhì)或細胞核，p53定位于細胞核。隨機選取5個以上高倍視野（×400），每個高倍視野計數(shù)不少于200個細胞中的陽性細胞數(shù)，以細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)陽性信號的細胞數(shù)＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。不同組織間MYBL2和p53表達差異采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關對胃癌組織中MYBL2和p53的表達行相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中表達的比較MYBL2陽性表達為細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒（圖1-2，見插頁），p53蛋白陽性表達為細胞核呈現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒（圖3-4，見插頁）。MYBL2和p53在胃癌組織中陽性率分別為62.50%（55/88）、70.45%（62/88），癌旁組織中陽性表達率分別為12.50%（11/88）、10.22%（9/88），胃癌組織中MYBL2和p53表達明顯高于癌旁組織（均P＜0.05）。見表1。

表1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中的表達[例（%）]

2.2 MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系隨著胃癌患者臨床分期增加、浸潤深度加深及淋巴結發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，胃癌組織中MYBL2和p53表達進一步升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤大小及分化程度間的表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 胃癌組織中MYBL2表達和p53表達的相關性88例胃癌組織中MYBL2表達陽性和p53表達陽性者51例，MYBL2表達陰性和p53表達陰性者 22例，胃癌組織中MYBL2表達和p53表達呈正相關（r=0.630，P=0.000）。見表 3。

3 討論

MYBL2位于染色體20q13，是Myb轉(zhuǎn)錄因子家族的高度保守成員，并且在增殖細胞中普遍表達，特別是在胚胎干細胞和成人造血前體[8]。在生理情況下，MYBL2調(diào)節(jié)細胞周期進展、細胞存活和細胞分化，然而在惡性腫瘤中常常發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)，能夠顯著促進腫瘤的發(fā)生和進展[9]。Liang等[10]報道，膽囊癌組織中MYBL2表達增加，且與膽囊癌患者的組織學分級，腫瘤浸潤深度，臨床分期和不良總生存率有關。體外實驗顯示，MYBL2表達的下調(diào)可抑制膽囊癌細胞增殖和DNA復制以及裸鼠異種移植腫瘤的生長。相反，MYBL2過表達導致相反的效果。Tao等[11]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞中，敲除MYBL2表達能夠恢復上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達和細胞-細胞間的鏈接，抑制腫瘤細胞的侵襲、獨立性生長和腫瘤的形成。p53基因位于染色體17pl3，分為野生型和突變型兩種，編碼產(chǎn)物含有393個氨基酸的p53蛋白。野生型p53通過激活和下調(diào)基因表達而主要作為轉(zhuǎn)錄因子起作用，導致細胞周期停滯或細胞凋亡，是一種抑癌基因[12]。突變型p53基因的擴增具有促癌作用，可與野生型p53基因結合抑制其表達，誘導細胞過度增殖、凋亡細胞明顯減少，最終引起惡性腫瘤的發(fā)生[13]。

表2 MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系[例（%）]

表3 MYBL2和p53在胃癌組織中表達的相關性

本實驗結果表明，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白陽性表達率分別為62.50%、70.45%，癌旁組織中分別為12.50%、10.22%，胃癌組織中MYBL2和p53的表達均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。表明MYBL2和p53表達升高可能與胃黏膜上皮癌變的發(fā)生有關，與Yu等[14]在胰腺導管腺癌中的文獻報道一致。結合胃癌患者臨床病理資料進行分析，MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素關系的結果顯示，隨著胃癌患者臨床分期進展、浸潤深度加深及淋巴結發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，MYBL2和p53陽性表達率進一步升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示MYBL2和p53表達與胃癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移有關。Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織中MYBL2和p53表達共陽性者51例，表達共陰性者22例，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達呈正相關（P＜0.05）。有研究顯示，p53-p21-DREAM途徑抑制MYBL2表達，特別是在細胞應激的條件下，如DNA損傷。然而在p53基因突變的腫瘤中調(diào)控細胞周期進程和細胞存活的MYBL2基因異常[15]。表明MYBL2和突變型p53是一對協(xié)同作用因素，可能通過某種調(diào)節(jié)機制參與胃癌的發(fā)生、進展過程。

綜上所述，與癌旁組織比較，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白存在過表達，其異常表達與胃癌患者的臨床分期、浸潤深度及淋巴結是否轉(zhuǎn)移密切相關，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達呈正相關。聯(lián)合檢測MYBL2和p53有助于評估胃癌的生物學行為和預后，為胃癌的靶向治療和進一步研究其浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制提供理論基礎。

圖1 MYBL2表達的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖2 MYBL2在胃癌組織中陽性表達（En Vision法，×400）

圖3 p53表達的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖4 p53在胃癌組織中陽性表達（En Vision法，×400）

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