陳阿瓊 黃茜茜 葉璐璐 薛向陽 林巧愛 朱小春 李聲東

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)的慢性自身免疫性疾病，針對(duì)細(xì)胞核抗原產(chǎn)生自身反應(yīng)性抗體是其主要標(biāo)志[1]。SLE患者的B細(xì)胞受損且不能區(qū)分自身抗原和非自身抗原，導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)自身抗原的抗體并觸發(fā)過度炎癥反應(yīng)[2]。microRNAs（miRNAs）是一類小的（21~25個(gè)核苷酸）、非編碼RNA，其通過與靶向mRNA序列的堿基配對(duì)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)[3]。有時(shí)miRNA可僅以2倍差異表達(dá)來調(diào)控靶基因從而減少蛋白質(zhì)表達(dá)[4]。因此，相當(dāng)難以識(shí)別在發(fā)生某些疾病時(shí)產(chǎn)生特定miRNA的生理功能。近年來已經(jīng)提出miRNAs作為SLE中免疫過程的重要調(diào)節(jié)劑[5-6]。miR-155為典型的多效miRNA，能廣泛調(diào)控免疫功能，包括T和B細(xì)胞活化，炎癥反應(yīng)和免疫記憶[7]，其通過靶向少數(shù)基因如 SHIP1[8]、SCOS1[9]和 S1PR1[10]等增強(qiáng)免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的過度活化。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、SLE等自身免疫性疾病中均可見其發(fā)揮致病作用[11]。在狼瘡小鼠模型中，miR-155的缺失減少了自身抗體的產(chǎn)生，可通過調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖來減輕狼瘡樣疾病[12]。為進(jìn)一步探究miR-155在SLE患者B細(xì)胞中的作用，筆者檢測(cè)SLE患者和健康人B細(xì)胞中miR-155的表達(dá)水平，并利用miRNA抑制劑干預(yù)后進(jìn)一步檢測(cè)IgG水平，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2011年2至12月和2014年6至12月溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院的SLE患者共66例，均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，男 9 例，女 57 例，年齡 28～52（39.75±10）歲。選取同院體檢中心同期健康體檢者10例作為健康對(duì)照組，男 2 例，女 8 例，年齡 26～50（38±12）歲，年齡與性別與SLE患者匹配。

1.2 主要試劑與儀器 Tri-Reagent BD試劑購自美國Invirtogen，miRNA檢測(cè)試劑盒購于德國Qiagen公司，CD19 MicroBeads（human）購于德國 Miltenyi公司，人IgG ELISA檢測(cè)試劑盒購于瑞典Mabtech公司，人淋巴細(xì)胞分離液購于天津?yàn)笊锕?，DEPC水購自寶生物工程（大連）有限公司，ABI 7500型定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 采集新鮮外周靜脈血5ml，EDTA抗凝，3 000r/min離心10min，用移液槍吸出上層血漿至1.5ml EP管中，細(xì)胞沉淀用于外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離。

1.3.2 PBMC的分離 細(xì)胞沉淀采用0.9%氯化鈉注射液1：2重懸；取6ml細(xì)胞懸液小心緩慢地用吸管加于6ml淋巴細(xì)胞分離液的液面之上，400g，離心20min；離心管中分層后，收集第二層的乳白色淋巴細(xì)胞放入含0.9%氯化鈉溶液4～5ml的試管中，充分混勻。再次離心，400g，離心20min。沉淀經(jīng)0.9%氯化鈉溶液反復(fù)洗2次即可得到所需的PBMCs。

1.3.3 外周血B細(xì)胞的分離 磁珠分離B細(xì)胞采用陰性選擇的原理，即被標(biāo)記的非B淋巴細(xì)胞保留在分離柱的磁場(chǎng)內(nèi)，而未被標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞通過了分離柱。流式細(xì)胞儀分析磁珠分選的B細(xì)胞的得率及純度。分離的PBMCs細(xì)胞計(jì)數(shù)后，300g，離心10min，徹底吸出上清液；預(yù)冷B細(xì)胞分離緩沖液，按每107個(gè)細(xì)胞需40μl的比例加入重懸細(xì)胞；根據(jù)每107個(gè)細(xì)胞需10μl的比例加入B細(xì)胞抗體雞尾酒試劑，混勻；放入冰箱（2～8℃）孵育5min；每107個(gè)細(xì)胞加入30μl B細(xì)胞分離緩沖液；每107個(gè)細(xì)胞加入20μlB細(xì)胞分離磁珠試劑，混勻；放入冰箱（2～8℃）孵育10min；將分離柱置于分離器適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)內(nèi)，緩慢將孵育的細(xì)胞懸液加到分離柱中，同時(shí)收集流出的未被標(biāo)記的細(xì)胞液；加入500μl緩沖液洗柱，共3次；將分離柱移出分離柱的磁場(chǎng)內(nèi)，立即加入適當(dāng)?shù)木彌_液，將標(biāo)記的細(xì)胞推出至收集管中，即可得到分離出的B細(xì)胞。

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析B細(xì)胞純度 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。再將細(xì)胞懸液分為4管（106個(gè)細(xì)胞數(shù)/管），設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，加入直接標(biāo)記的一抗抗體，即抗人CD19-PE（1mg/1ml）5μl，終容量 100μl，具體為：實(shí)驗(yàn)組：B細(xì)胞+抗人CD19-PE；對(duì)照組1：B細(xì)胞；對(duì)照組2：PBMCs+抗人CD19-PE；對(duì)照組3：PBMCs。輕輕混勻后，避光，室溫孵育30min；孵育完成后，加入緩沖液PBS，300g離心5min，棄去上清液，重復(fù)1次；重懸細(xì)胞后，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 B細(xì)胞RNA的抽提 B淋巴細(xì)胞（105個(gè)細(xì)胞數(shù)/份）加入TRIzol試劑1ml，充分混勻后室溫靜置5min；加氯仿 200μl，混勻后冰上靜置 5min，4℃，12 000r/min離心15min，可見分層；取上層水相移至新的無酶EP管中，加入等體積異丙醇，充分混勻后，置于-20℃冰箱中過夜；4℃，12 000r/min離心15min，吸出上清液，留白色沉淀；加入1ml75%乙醇，4℃，8 000r/min離心15min后棄上清液；再次離心1min后，吸盡乙醇留白色沉淀；打開EP管蓋，冰上晾干至乙醇完全揮發(fā)，再加入DEPC處理水20μl溶解RNA，測(cè)濃度后-80℃保存。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)miR-155的表達(dá) 取提取的RNA以miR-155莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，20μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含：miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl，10×miScript Nucleics Mix 2μl，5×miScript HiSpec Buffer 4μl，RNase-Free Water variable，Total RNA template 10pg-1μg，混勻，微離心置于冰上；37℃逆轉(zhuǎn)錄60min，95℃酶失活5min；-20℃保存逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA或立即用于real-time PCR。real-time PCR：所用試劑置于冰上，取出制備好的cDNA，每個(gè)樣本作2個(gè)復(fù)孔；避光操作，調(diào)制20μl反應(yīng)體系：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10μl，10× miScript Universal Primer 2μl，10×miScript Primer Assay 2μl,RNase-Free Water variable，Template cDNA ≤2μl。反應(yīng)起始條件 95℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)條件（40個(gè)循環(huán)）94℃變性 15s，55℃退火30s，70℃延伸 30s，用 real-time PCR儀附帶的軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，獲得每個(gè)孔中熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)，即Ct值。

1.3.7 細(xì)胞miRNA干預(yù)實(shí)驗(yàn) 為評(píng)價(jià)miR-155對(duì)B細(xì)胞功能的影響，我們通過miRNA抑制劑下調(diào)miR-155的表達(dá)，采用ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液IgG水平變化。由于常規(guī)的轉(zhuǎn)染方案難以將基因?qū)隑細(xì)胞，本研究采用電轉(zhuǎn)染方式對(duì)B細(xì)胞內(nèi)的miRNA進(jìn)行干預(yù)。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，6孔板培養(yǎng)，106個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)；清洗電轉(zhuǎn)杯，75%乙醇浸泡1h后，無水乙醇浸泡0.5h后，紫外照射至乙醇完全揮發(fā)，放于-20℃過夜；6孔板內(nèi)分別加入106個(gè)細(xì)胞及10μl mimics/mimics-NC/miRNA inhibitor/miRNA inhibitor-NC/Control（電轉(zhuǎn)但不加 miRNA）/Blank（不電轉(zhuǎn)也不加 miRNA），混勻，將溶液轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，按250V、10ms設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù)；將電轉(zhuǎn)杯置于恒溫培養(yǎng)箱10min，使miRNA充分進(jìn)入；將細(xì)胞懸液接種于預(yù)熱的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞，待檢測(cè)。

1.3.8 IgG抗體檢測(cè) 收集的細(xì)胞上清液，12 000r/min，4℃，10min離心備用；從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條；空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本通用稀釋液，其余孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品（100μl/孔），用封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育90min；提前20min準(zhǔn)備酶標(biāo)抗體工作液；洗板5次；空白孔加酶標(biāo)抗體稀釋液，其余孔加入酶標(biāo)抗體工作液（100μl/孔），用新封板膠紙封住反應(yīng)孔，36℃孵箱孵育30min；洗板5次；打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序；加入顯色底物（TMB）100μl/孔，避光 36℃孵箱，避光孵育 15min；加入終止液100μl/孔，混勻后即刻測(cè)量OD450值（3min內(nèi)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，剔除CT值＞35或溶解曲線不合格的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血B細(xì)胞分離及純度鑒定 見圖1。

圖1 B細(xì)胞純度流式鑒定

由圖1可見，A01所示為沒有加CD19-PE抗體的B細(xì)胞對(duì)照管，目的是收集細(xì)胞以便劃分實(shí)驗(yàn)管的細(xì)胞區(qū)域。A02是加有CD19-PE抗體的B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)管，在對(duì)照第一管劃分的基礎(chǔ)上，PE通道的細(xì)胞有約92%，即分離的B細(xì)胞純度能達(dá)到約92%。

2.2 SLE患者和健康對(duì)照組B細(xì)胞miR-155表達(dá)水平比較 見圖2。

圖2 SLE患者和健康對(duì)照組B細(xì)胞miR-155表達(dá)水平比較

由圖2可見，與健康對(duì)照組比較，miR-155在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)（t=3.192，P＜0.05）。

2.3 miRNA干預(yù)對(duì)B細(xì)胞分泌IgG的影響 見圖3。

圖3 B細(xì)胞miRNA電轉(zhuǎn)染干預(yù)效率流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)

由圖3可見，熒光標(biāo)記的miR-155轉(zhuǎn)染效率后流式細(xì)胞儀檢測(cè)攜帶熒光的細(xì)胞數(shù)量，B細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約40%。

2.4 SLE患者外周血B細(xì)胞miR-155干預(yù)48h后IgG水平 見圖4。

圖4 SLE患者外周血B細(xì)胞miR-155干預(yù)48h后IgG水平

由圖4可見，SLE患者B細(xì)胞上調(diào)表達(dá)的miR-155，通過miRNA抑制劑干預(yù)48h后，分泌的IgG水平明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

B細(xì)胞通過多重途徑在SLE發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵作用，其中最主要途徑是B細(xì)胞產(chǎn)生病理性自身抗體，并通過形成免疫復(fù)合物、激活補(bǔ)體和直接細(xì)胞毒性引起組織損傷，基于耗竭B細(xì)胞的藥物，如利妥昔單抗等，在常規(guī)臨床實(shí)踐中用于治療頑固性SLE[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在活化的B細(xì)胞中表達(dá)且可能發(fā)揮著重要作用[14]，Vigorito等[15]發(fā)現(xiàn)miR-155缺乏的B細(xì)胞出現(xiàn)濾泡外和生發(fā)中心反應(yīng)減少。本研究采用qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)miR-155在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。此外，采用miRNA抑制劑降低B細(xì)胞中miR-155的表達(dá)后，檢測(cè)到細(xì)胞上清液IgG水平明顯減少，提示miR-155可調(diào)控B細(xì)胞產(chǎn)生IgG，進(jìn)一步證實(shí)miR-155是SLE患者B細(xì)胞功能相關(guān)的miRNA。miR-155在B細(xì)胞中如何發(fā)揮作用需要進(jìn)一步研究。Vigorito等[15]通過miR-155-缺陷B細(xì)胞中基因表達(dá)的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)總共185個(gè)蛋白編碼基因受到顯著影響，特別是PU.1（Ets家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子）被鑒定為B細(xì)胞中miR-155的功能靶區(qū)，野生型原代B細(xì)胞中的強(qiáng)制表達(dá)PU.1可導(dǎo)致表達(dá)IgG1細(xì)胞比例降低。多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)表明miR-155-SHIP1軸也可能在調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和存活中起重要作用[8,16]。近期又有研究證實(shí)miR-155直接抑制Jumonji家族成員JARID2，從而減少B細(xì)胞凋亡[17]。

B細(xì)胞的過度活化被認(rèn)為是SLE重要發(fā)病機(jī)制，miR-155在B細(xì)胞中的調(diào)控或許與SLE疾病發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。2015年Liu等[18]報(bào)道在EBV等特定病毒或細(xì)菌感染后，SLE患者B細(xì)胞中的miR-155可以在TLR9誘導(dǎo)下靶向作用于CD1d的3′-UTR區(qū)域，從而損害B細(xì)胞的抗原呈遞功能。同年Lou等[19]報(bào)道，miR-155與B細(xì)胞抗體反應(yīng)有關(guān)。這些報(bào)道均證實(shí)了miR-155與SLE患者B細(xì)胞的功能息息相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也提示miR-155的過度表達(dá)可能通過促進(jìn)SLE患者B細(xì)胞產(chǎn)生IgG，促進(jìn)自身抗原抗體復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷。當(dāng)然，miR-155如何在SLE中調(diào)控B細(xì)胞發(fā)揮致病作用仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，miR-155從多方面影響B(tài)細(xì)胞的功能，本研究也證實(shí)miR-155在SLE患者B細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且抑制miR-155可降低B細(xì)胞產(chǎn)生IgG，這也為改善SLE治療提供可行的新策略。

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