葛 冰，蔡 靜，鐘 鳳，馬愛(ài)國(guó)

(青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/青島大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康研究院，山東青島 266021)

研究表明，高尿酸血癥與某些腎臟疾病[1-3]、心血管疾病[4]的發(fā)生發(fā)展亦存在聯(lián)系。維生素B2在體內(nèi)是以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式與特定的蛋白形成黃素蛋白，而黃素蛋白又是機(jī)體許多酶系統(tǒng)的重要組成成分，參與機(jī)體許多重要的代謝反應(yīng)。體內(nèi)的維生素B6是以5’—磷酸吡哆醛(PLP)的形式參與多種代謝反應(yīng)，與氨基酸代謝有密切關(guān)系[5]。B族維生素可以通過(guò)降低黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生氧自由基及過(guò)氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少尿酸的生成[6-7]；此外，維生素B2和維生素B6也可通過(guò)抑制同型半胱氨酸的水平從而達(dá)到降低尿酸的作用[6]，但其降低尿酸效果及機(jī)制仍待深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用維生素B2、B6及B2和B6聯(lián)合干預(yù)，觀察維生素B2、維生素B6對(duì)大鼠高尿酸血癥的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：氧嗪酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；別嘌呤醇，世貿(mào)天階制藥有限公司；維生素B2片、維生素B6片，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司；黃嘌呤氧化酶(XOD)測(cè)試盒、腺苷脫氨酶(ADA)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

儀器設(shè)備：離心機(jī)、722分光光度計(jì)、全自動(dòng)生化分析儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只6w齡體質(zhì)量為200±20g的雄性SD大鼠(購(gòu)自山東省魯抗制藥有限公司，合格證為SCXK魯20140007)按體重分為6組，分別為空白對(duì)照組(C組)、氧嗪酸鉀模型組(HU組)、陽(yáng)性對(duì)照 (AL)組、維生素B2(B2)組、維生素B6(B6)組、維生素B2+B6(BB)組，每組各12只。每6只大鼠同籠飼養(yǎng)，維持室溫在25℃左右。C組大鼠給予普通顆粒飼料喂養(yǎng)，飼料主要成分包括蛋白質(zhì)(20%以上)、脂肪(4%)、粗纖維(5%)、灰分(8%)、水分(10%)等。其余各組給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%酵母飼料喂養(yǎng)(將大鼠普通粉狀飼料中均勻加入酵母膏，最后將飼料重新制作成團(tuán)狀)。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠給予1g/(kg·d·BW)氧嗪酸鉀灌胃；在此基礎(chǔ)上，AL組大鼠給予別嘌呤醇20mg/(kg·d·BW)，B2組大鼠給予1.18mg/(kg·d·BW)VitB2灌胃、B6組大鼠給予23.73mg/(kg·d·BW)VitB6灌胃、BB組大鼠給予1.18mg/(kg·d·BW)VitB2+23.73mg/(kg·d·BW)VitB6灌胃；灌胃體積均為5 mL/(kg·d·BW)，所有大鼠均自由飲水(自來(lái)水)和進(jìn)食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清尿酸(SUA)、尿素(Urea)、肌酐(SCr)等指標(biāo)的測(cè)定 在干預(yù)的第0、4、12周，早晨8點(diǎn)，大鼠禁食12h后剪尾取血1.0～1.5mL。放置于室溫中，靜置凝血30min以上，在4℃條件下離心，以3 000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，再取300μL血清，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定SUA水平。干預(yù)16w末，大鼠禁食12 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，留取血清，檢測(cè)SUA、Urea和SCr水平。

1.3.2 肝勻漿中黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶的檢測(cè) 干預(yù)16w末，大鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉處死，摘取各組大鼠新鮮肝臟組織制成10%肝勻漿。取100 μL 10%肝勻漿測(cè)定XOD活性，取50 μL肝均漿，測(cè)定ADA活性，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 大鼠病理切片的制備 大鼠處死后，取出右側(cè)腎臟，縱向剖開(kāi)放于固定液(10%中性福爾馬林)中固定>24 h以上用石蠟包埋。常規(guī)脫蠟后，制成3 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì)方差分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，納入分析的數(shù)據(jù)為HU組、B2組、B6組以及BB組的SUA、XOD及ADA等數(shù)據(jù)。對(duì)于交互作用，檢驗(yàn)結(jié)果P<0.05，表明VitB2和VitB6之間存在交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠SUA水平

如圖1所示，干預(yù)4w后，各組大鼠SUA水平均呈明顯上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異。干預(yù)到第12w末，HU組大鼠SUA水平達(dá)到303.00 μmol/L，明顯高于其他各組(P<0.05)；而其余各組大鼠SUA水平與C組相比，差異并不明顯。干預(yù)16w末，HU組、B2組、B6組、BB組大鼠SUA水平分別達(dá)到了369.58、281.58、290.70、294.42 μmol/L，與C組相比顯著升高(P值均<0.05)。而與HU組相比，AL組、B2組、B6組、BB組大鼠血尿酸水平明顯降低(P值均<0.05)。說(shuō)明維生素B2和維生素B6對(duì)高尿酸血癥大鼠SUA水平有明顯的改善作用。

圖1 各組大鼠SUA水平

2.2 各組大鼠Urea、SCr水平

如表1所示，與HU組相比，B2組、B6組、BB組大鼠Urea水平分別降低了20.14%、16.61%、16.47%(P值均<0.05)。SCr結(jié)果顯示，與C組相比，HU組明顯升高，而B(niǎo)2組、B6組、BB組降低(P值均<0.05)。與HU組相比，B2組、B6組、BB組大鼠SCr水平分別降低了23.98%、22.21%、21.56%(P值均<0.05)。

表1 各組大鼠Urea及SCr情況

注：a與C組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；b與HU組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；c與AL組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

2.3 各組大鼠腎臟病理切片結(jié)果

如圖2所示，C組、AL組、B6組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎皮質(zhì)中腎小球分布均勻，大小正常，腎小管無(wú)腫脹變性，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而HU組、B2組、BB組大鼠的腎臟可見(jiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但無(wú)明顯纖維化。其中，HU組大鼠腎臟組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度最高。

圖2 各組大鼠腎臟病理改變(HE染色，200×)注：A：空白對(duì)照組(C組)；B：模型組(HU組，箭頭所指為炎性細(xì)胞)；C：陽(yáng)性對(duì)照組(AL組)；D：維生素B2組(B2組，箭頭所指為炎性細(xì)胞)；E：維生素B6組(B6組)；F：維生素B2+B6組(BB組，箭頭所指為炎性細(xì)胞)

2.4 各組大鼠肝勻漿XOD、ADA活性

如表2所示，干預(yù)16w末，HU組、B6組、BB組大鼠肝勻漿XOD活力顯著高于C組(P值均<0.05)，分別達(dá)到了78.11、70.15、72.32 U/gprot。與HU組相比，其余各組大鼠肝勻漿XOD活力明顯降低(P值均<0.05)。與BB組相比，AL組和B2組大鼠肝勻漿XOD活力有明顯降低(P值均<0.05)。干預(yù)16w末，與C組相比，HU組大鼠肝勻漿ADA活力明顯升高(P<0.05)，達(dá)到了459.38 U/gprot；而其余各組與C組之間的差異并不明顯。與HU組相比，AL組、B2組和B6組大鼠肝勻漿ADA的活力明顯降低(P值均<0.05)。

2.5 維生素B2、維生素B6聯(lián)合作用分析

交互作用分析結(jié)果顯示，維生素B2與維生素B6對(duì)12w及16wSUA、XOD及ADA的影響不存在交互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)分析了VitB2和VitB6的主效應(yīng)(表3)。結(jié)果顯示，VitB2(B2組與BB組)干預(yù)與非VitB2(B6組和HU組)干預(yù)相比，VitB2可以有效降低高尿酸血癥大鼠的SUA和肝臟XOD活性(P值均<0.05)，而對(duì)ADA的影響并不明顯。VitB6(B6組與BB組)干預(yù)與非VitB6(B2組和HU組)干預(yù)相比，VitB6僅對(duì)16w末大鼠SUA的水平有降低的作用，而對(duì)大鼠肝臟XOD和ADA活性無(wú)明顯的影響。

組別數(shù)量XODADAC1261.32±7.83338.74±77.39HU1278.10±5.69a459.38±75.42aAL1265.13±5.07bc361.48±106.70bB21265.29±4.48bc355.97±126.34bB61270.15±5.17ab385.00±90.33bBB1272.32±6.73ab405.94±63.00

注：a與C組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；b與HU組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；c與AL組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

表3 維生素B2與維生素B6對(duì)高尿酸血癥大鼠SUA、XOD、ADA析因設(shè)計(jì)分析結(jié)果

注：維生素B2干預(yù)包括B2組和BB組；維生素B6干預(yù)包括B6組和BB組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用酵母飼料喂養(yǎng)與氧嗪酸鉀灌胃建立大鼠高尿酸血癥模型[2，8-12]。攝入大劑量的酵母，可引起嘌呤代謝紊亂、黃嘌呤氧化酶活性增加，從而使尿酸的生成增加，產(chǎn)生高尿酸血癥[6]。氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑，可以抑制尿酸酶的活性，減少尿酸分解，從而造成血尿酸升高[13-14]。由于大鼠體內(nèi)存在尿酸酶，因而選擇酵母與氧嗪酸鉀聯(lián)用來(lái)建立模型。

食物中攝入嘌呤過(guò)多、內(nèi)源性嘌呤生成過(guò)多、嘌呤代謝速度增加均可引起尿酸生成過(guò)多。食物中50%的RNA、25%的DNA都最終要以尿酸的形式排泄[15]。酵母中含有大量的遺傳物質(zhì)嘌呤，當(dāng)攝入大量酵母時(shí)，嘌呤會(huì)經(jīng)核苷酶分解為次黃嘌呤，后者經(jīng)過(guò)黃嘌呤氧化酶(XOD)作用代謝為黃嘌呤，經(jīng)進(jìn)一步代謝最終形成大量尿酸[16-19]。研究表明，葉酸等B族維生素可以通過(guò)降低黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生氧自由基及過(guò)氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而同時(shí)減少了SUA生成[7，20-21]。維生素B2是以 FMN和FAD輔酶形式與蛋白質(zhì)結(jié)合存在，參與機(jī)體許多代謝反應(yīng)。FAD作為輔酶參與維生素B6轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿徇炼呷┑倪^(guò)程，而且維生素B2缺乏可引起亞甲基四氫葉酸還原酶的活性降低，引起葉酸代謝異常。因此，缺乏維生素B2可能會(huì)影響到黃嘌呤氧化酶的活性，從而影響機(jī)體尿酸水平。而本實(shí)驗(yàn)顯示，B2組、B6組及BB組大鼠肝勻漿中XOD的活性較HU組明顯降低，證明補(bǔ)充維生素B2、維生素B6及兩者聯(lián)合應(yīng)用，可以通過(guò)降低XOD活性，從而達(dá)到降低尿酸生成的效果。

腺苷脫氨酶(ADA)也是嘌呤核苷代謝中重要的酶類，其代謝終產(chǎn)物為尿酸[16-18]。本實(shí)驗(yàn)顯示，B2、B6組大鼠肝勻漿中ADA的活性較HU組顯著降低，證明維生素B2、維生素B6可以通過(guò)降低ADA活性，從而達(dá)到降低血尿酸生成的效果。

尿素的濃度在一定程度上可反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的損害程度，是常用的腎功能指標(biāo)之一。臨床上檢測(cè)血肌酐是了解腎功能的主要方法之一，是腎臟功能的重要指標(biāo)，血清肌酐升高意味著腎功能的損害[22]。本實(shí)驗(yàn)中，HU組大鼠血清尿素及肌酐水平均升高，證明HU組大鼠的腎臟有一定程度的損傷，尿酸的排泄受到了一定的影響。而B(niǎo)2組、B6組及BB組大鼠Urea與SCr較HU組降低，提示維生素B2、維生素B6以及兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)高尿酸血癥大鼠的腎臟有一定的保護(hù)作用，從而影響其SUA的水平。從腎臟組織病理學(xué)結(jié)果也可以看出，HU組大鼠的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度最高，其腎臟的損傷程度較其他組嚴(yán)重。而B(niǎo)2組及BB組大鼠的浸潤(rùn)程度較低，提示維生素B2可以改善高尿酸血癥大鼠的腎臟功能。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用維生素B2、維生素B6以及維生素B2與B6聯(lián)合應(yīng)用對(duì)高尿酸血癥大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，B2、B6組及BB組大鼠的SUA水平仍高于C組，與模型組相較，維生素B2、B6組及BB組血尿酸(SUA)水平明顯降低；但析因分析結(jié)果沒(méi)有顯示維生素B2和維生素B6之間對(duì)高尿酸血癥大鼠的SUA、XOD、ADA的交互作用；提示維生素B2、維生素B6對(duì)高尿酸血癥大鼠的SUA水平有一定的改善作用。鑒于該研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，維生素B2、B6對(duì)人群嘌呤代謝和尿酸水平影響以及對(duì)高尿酸血癥或痛風(fēng)的預(yù)防和改善作用尚待進(jìn)一步研究。◇

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