馬敏麗，美力班·吐爾遜，王振芳，阿仙姑·哈斯木

(1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊　830011；2解放軍第四七四醫(yī)院病理科，烏魯木齊　830013；3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，烏魯木齊　830011)

基于轉(zhuǎn)錄組測序分析宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒16感染對泛素蛋白連接酶、核因子-κB表達的影響

馬敏麗1,2，美力班·吐爾遜3，王振芳1，阿仙姑·哈斯木3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊830011；2解放軍第四七四醫(yī)院病理科，烏魯木齊830013；3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，烏魯木齊830011)

摘要：目的探討新疆婦女宮頸病變中Toll樣受體9(TLR9)和泛素蛋白連接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表達與人乳頭狀瘤病毒16(HPV16)感染的關(guān)系。方法以人乳頭瘤病毒(HPV)分型基因芯片檢測86例慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌組織HPV感染及分型；Illumina Hiseq測序平臺對15例宮頸病變組織進行轉(zhuǎn)錄組測序；通過免疫組化SP法檢測TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CINⅡ-Ⅲ 和宮頸癌患者石蠟包埋組織中的表達水平。結(jié)果宮頸癌的HPV感染率為100%(41/41)，CINⅡ-Ⅲ的感染率為60%(15/25)，慢性宮頸炎的感染率為15%(3/20)，其中HPV16為主要感染型別；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因有12個(NF-κB、UBC、TICAM1、POU2F3、S100A8、NOD2、CDK1、FOS、JUN、MAL、IRF7和RP11-58O9.2)；免疫組化結(jié)果顯示TLR9、UBC和NF-κB在CIN和宮頸癌組織中高表達，其表達水平呈正相關(guān)(r分別為0.510和0.469，P值均<0.001)。結(jié)論在宮頸癌發(fā)展過程中，HPV16感染可能通過泛素-蛋白酶體降解途徑影響TLR9 蛋白表達，具體調(diào)控機制需要深入研究。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；人乳頭狀瘤病毒16；Toll樣受體9；泛素蛋白連接酶；核因子-κB

中圖分類號：R737.33

文獻標識碼：A

文章編號：1009-5551(2018)05-0534-05

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金-聯(lián)合基金(2017D01C227)

作者簡介：馬敏麗(1983- )，女，在讀碩士，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。

通信作者：阿仙姑·哈斯木，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:婦科腫瘤,E-mail:axiangu75@126.com。

本文引用：馬敏麗，美力班·吐爾遜，王振芳,等.基于轉(zhuǎn)錄組測序分析宮頸病變中人乳頭狀瘤病毒16感染對泛素蛋白連接酶、核因子-κB表達的影響[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,41(5):534-538.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.003

EffectofHPV16infectionontheexpressionofUBCandNF-κBincervicallesionsbasedontranscriptomesequencing

MAMinli1,2,MeilibanTuerxun3,WANGZhenfang1,AxianguHasimu3

(1GraduateSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China；2No.474People′sLiberationArmyHospital,Urumqi830013;3DepartmentofPathologyandAnatomy,SchoolofPre-clinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expressions of Toll-like receptor 9(TLR9),Ubiquitin ligases(UBC),Nuclear factor-κB(NF-κB)and human papilloma-virus(HPV)16 in cervical lesions of Xinjiang women.MethodsEighty-six cases of Uyghur chronic cervicitis,cervical intraepithelial neoplasia(CIN)and cervical cancer HPV infection and typing were detected by HPV typing gene chip;Illumina Hiseq sequencing platform was used for transcriptome sequencing of 15 cervical lesion tissues.The expression of TLR9,UBC and NF-κB in paraffin-embedded tissues of patients with chronic cervicitis,CIN Ⅱ-Ⅲ and cervical cancer were detected by immunohistochemical SP method.ResultsThe HPV infection rate of cervical cancer was 100%(41/41),the infection rate of CIN Ⅱ-Ⅲ was 60%(15/25),and the infection rate of chronic cervicitis was 15%(3/20),of which HPV16 was the major infection type.Transcriptome sequencing results showed that there were 12 TLR9-related different up-regulated genes(TLR9,NF-κB,UBC,TICAM1,POU2F3,S100A8,NOD2,CDK1,FOS,JUN,MAL and IRF7)in HPV16-positive cervical cancer and CIN Ⅱ-Ⅲ tissue.Immunohistochemistry results showed that TLR9,UBC9 and NF-κB were highly expressed in CIN and cervical cancer tissues,and their expression levels were positively correlated(r=0.510 and 0.469,P<0.001,respectively).ConclusionHPV16 infection may affect the expression of TLR9 protein in women through the ubiquitin-proteasomal degradation pathway,in which the specific regulatory mechanisms need to be further studied.

Keywords:cervical cancer;human papillomavirus 16(HPV 16);cervical cancer;Toll-like receptor 9(TLR9);ubiquitin ligases(UBC);nuclear factor-κB(NF-κB)

人乳頭瘤病毒(HPV)是導(dǎo)致宮頸癌病變的主要因素，尤其是高危型HPV16、18長期持續(xù)感染是引起宮頸上皮癌變的重要原因[1]。Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)家族在早期固有免疫中對入侵病原微生物的識別發(fā)揮重要作用[2-3]。目前，已發(fā)現(xiàn)的人類TLR家族成員中識別病毒的有:TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和 TLR9,其中TLR9能識別細菌、病毒的核酸成分，通過介導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[4-5]。課題組前期在宮頸癌組織標本以及宮頸癌細胞系中，對TLRs及相關(guān)分子進行檢測，發(fā)現(xiàn)HPV16 陽性宮頸癌組織和細胞系中TLR9表達缺失[6]；并且利用RNAi技術(shù)抑制HPV16陽性宮頸癌細胞中E6、E7 mRNA表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA干擾引起腫瘤細胞表面TLR9分子的重新表達。以上研究證明宮頸癌組織TLR9表達缺陷與高危型HPV16編碼的E6、E7蛋白有密切聯(lián)系[7]。可見，TLR9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控發(fā)生異?？赡苁荋PV和腫瘤細胞賴以生存的必要前提或必然結(jié)果[8]。目前關(guān)于任何TLR及其功能途徑、宮頸癌進程和HPV感染等三者之間關(guān)系尚未形成系統(tǒng)認識，甚至對TLR9表達調(diào)控與宮頸癌的關(guān)系也存在爭議。綜上，本課題旨在探討新疆婦女宮頸病變中TLR9和泛素蛋白連接酶(UBC)、核因子-κB(NF-κB)表達與HPV16感染的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1研究對象收集2015-2017年在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)診斷確診的慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌(CSCC)患者的石蠟包埋組織標本共86例。其中包括慢性宮頸炎石蠟包埋標本20例，CINⅡ-Ⅲ石蠟包埋標本25例，宮頸癌石蠟包埋標本41例(高分化鱗癌21例，中低分化鱗癌20例)。其中15例宮頸病變新鮮組織進行轉(zhuǎn)錄組測序(分別為正常宮頸HPV陰性、正常宮頸HPV16陽性、CINⅡ-Ⅲ HPV16陰性、CINⅡ-Ⅲ HPV16陽性和宮頸癌HPV16陽性組織各3例)。

1.2主要儀器與試劑ABI9700PCR擴增儀、Illumina Hiseq測序平臺。免疫組化SP法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、UBC兔抗人多克隆抗體[Abcam(上海)貿(mào)易有限公司]、NF-κB兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)和TLR9兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

Arzberg在 1920 年末與Hermann Gretsch大師合作推出新系列“1382”而名垂千史，該系列產(chǎn)品從1931 年便炙手可熱，有一位評論家給“1382”極高的評價，稱之“實用、樸實，簡潔的風(fēng)格比膚淺的時尚更具經(jīng)典意義”。

1.3方法

1.3.1組織HPV基因型檢測采用ABI9700PCR擴增儀和人乳頭瘤病毒(HPV)分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)(HPV-GenoCam-9600)進行結(jié)果判讀。提取組織DNA，取2μL待測DNA樣品分別加至上述PCR反應(yīng)管中。PCR的循環(huán)參數(shù)設(shè)定為：預(yù)變性50℃2min，95℃10min，然后95℃30s，52℃45s，65℃30s，共40循環(huán)，總延伸65℃5min，擴增完畢后將產(chǎn)物保存在-20℃冰箱。DNA雜交：轉(zhuǎn)移基因芯片至96孔板內(nèi)，取30μL的NaOH變性液加入PCR產(chǎn)物管，靜置10min。100μL的雜交液和60μL變性的PCR產(chǎn)物分別加入芯片孔中，在55℃下溫育30min，并吸干孔內(nèi)的液體。再加入150μL洗液B，漂洗3min，再次吸干液體；重復(fù)2次。顯色：取100μL的酶標工作液，加入芯片孔內(nèi)，在37℃下溫育30min；將孔內(nèi)液體吸干。再分別加入顯色液A水溶液和顯色液B，兩者均為50μL，輕搖混勻，于室溫下顯色5min，然后將孔內(nèi)液體吸干，并加入150μL洗液C，靜置1min，并吸干。使用HPV分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)對基因芯片進行檢測和分析。HPV-GenoCam-9600系統(tǒng)自動檢測靶點信號Intensity Value值(INS)，分析并報告結(jié)果：INS<11.0為HPV 陰性；INS≥11.0為HPV陽性，并報告HPV的型別。

1.3.2基于HiSeq 平臺對宮頸病變組織進行轉(zhuǎn)錄組的測序 實驗采用Illumina TruseqTM RNA 試劑盒方法構(gòu)建文庫。(1)提取總RNA、富集mRNA：從組織中提取總RNA，用Nanodrop 2000 檢測所提取的RNA 的濃度和純度，通過瓊脂糖凝膠電泳法來檢測RNA 的完整性，再用Agilent2100 測定RIN值。用帶有Oligo(dT)的磁珠與ployA 進行A-T 堿基配對，將mRNA從總RNA中分離出來，用于分析轉(zhuǎn)錄組信息。(2)mRNA的片段化：富集所獲得的mRNA序列是完整的，長度達幾kb，因此要將其隨機打斷。(3)cDNA的合成：加入六堿基隨機引物并通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，隨后進行二鏈合成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。(4)連接adaptor并Illumina Hiseq 4000 上機測序。

1.3.3采用免疫組織化學(xué)法檢測TLR9和UBC、NF-κB蛋白表達情況用免疫組織化學(xué)SP法檢測法，切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化及抗原修復(fù)并阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗(TLR9、UBC和NF-κB兔抗人多克隆抗體濃度分別為1∶250、1∶500和1∶300)，并放入4℃冰箱里過夜，用PBS作為陰性對照。第2天加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明和封片。判斷結(jié)果，采用人工計數(shù)方法按染色細胞數(shù)和染色程度綜合計分。光學(xué)顯微鏡下全視野觀察，每張切片按所見陽性細胞范圍分為4個分值，陽性細胞范圍<5%記0分，5%～25%記1分，26%～75%記2分；>75%記3分。染色強度的判定：陰性染色記0分，弱陽性染色記1分，陽性染色記2分，強陽性染色記3分。綜合積分=(染色細胞分數(shù)+染色強度分數(shù))/2。

2　結(jié)果

2.1宮頸病變中HPV感染和基因型分布對86例宮頸病變標本進行HPV的檢測，其中包括宮頸癌41例，CINⅡ-Ⅲ 25例，慢性宮頸炎組織20例。宮頸癌的感染率為100%(41/41)，CINⅡ-Ⅲ的感染率為60%(15/25)，慢性宮頸炎的感染率為15%(3/20)。在HPV陽性的標本中有11個HPV基因型，在66例宮頸癌及CINⅡ-Ⅲ組織中有10例為多重感染，多重感染率為15.1%(10/66)。在20例慢性宮頸炎組織中有3例感染了HPV，且都是HPV16陽性。在檢測到的12個HPV基因型中高危型為10個，低危型2個。宮頸癌及CINⅡ-Ⅲ的HPV基因型分布，見圖1。

2.2宮頸病變中與HPV16感染和TLR9相關(guān)的差異表達基因使用Illumina Hiseq測序平臺4000對宮頸病變組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建Illumina PE文庫(200bp)進行2×151bp測序，對獲得的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，之后利用生物信息學(xué)手段對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因有12個，見表1。

表1　HPV16陽性宮頸癌和CIN組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因

2.3宮頸病變中TLR9、UBC和NF-κB蛋白表達TLR9、UBC和NF-κB在病變宮頸組織中呈強陽性表達，TLR9主要表達在病變宮頸鱗狀上皮的細胞膜和細胞質(zhì)，UBC主要表達在病變宮頸鱗狀上皮的細胞核和細胞質(zhì)，NF-κB主要表達在病變宮頸鱗狀上皮的細胞核和細胞質(zhì)，見圖2。

TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌中呈不同程度的陽性表達。在慢性宮頸炎組織中陽性表達率分別為40%、25%、50%，在CIN組織中陽性表達率分別為100%、88%、88%，在宮頸癌組織中陽性表達率分別為54%、73%、73%。隨著宮頸病變程度的加重，TLR9、UBC和NF-κB的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

2.4TLR9與UBC9、NF-κB表達水平的相關(guān)性TLR9在宮頸病變組織中的高表達與UBC、NF-κB的表達呈正相關(guān)(P<0.05)，Spearman相關(guān)系數(shù)r值分別為0.510和0469。UBC和NF-κB的表達也呈正相關(guān)(r=0.488,P<0.05),見表3、4。

慢性宮頸炎組織 CIN組織 宮頸癌組織

圖2　TLR9、UBC、NF-κB在宮頸各組織中的表達(×200)

表2TLR9、UBC和IκBα在不同宮頸組織中的表達情況/例(%)

分類例數(shù)TLR9陽性陰性χ2值P值UBC陽性陰性χ2值P值NF-κB陽性陰性χ2值P值慢性宮頸炎組織208(40.0)12(60.0)5(25.0)15(75.0)10(50.0)10(50.0)CIN組織2525(100.0)0(0.0)20.6320.00022(88.0)3(12.0)21.3970.00022(88.0)3(12.0)8.020.018宮頸癌組織4122(53.7)19(46.3)30(73.1)11(26.9)30(73.1)11(26.9)

表3　不同宮頸組織中TLR9與UBC、NF-κB表達的相關(guān)性/例

表4　不同宮頸組織中UBC與NF-κB表達的相關(guān)性/例

3　討論

宮頸癌是病因較明確的女性惡性腫瘤，80%的宮頸癌患者都能檢測到高危型HPV的感染[9-10]。但絕大多數(shù)女性的感染為一過性感染,可在12～18個月內(nèi)消除，只有少數(shù)(2%～3%)感染者免疫監(jiān)視和清除功能失敗導(dǎo)致其發(fā)展為宮頸癌[11]。所以機體的細胞免疫反應(yīng)功能障礙被認為是HPV持續(xù)性感染并發(fā)展致癌的重要原因。

TLR9作為TLRs家族重要成員之一，和絕大部分TLRs共享髓系分化因子88(MyD88)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[12]。Liu等[13]、Sato等[14]的研究示當(dāng)TLR9被配體激活后，MyD88將TIR二聚體與IRAK蛋白激酶連接，后者通過磷酸化激活泛素連接酶UBC，再經(jīng)過多步反應(yīng)，使NF-κB活化核轉(zhuǎn)，導(dǎo)致免疫應(yīng)答基因的激活，從而誘導(dǎo)多種細胞因子白細胞介素6(IL-6),腫瘤壞死因子α(TNF-α),干擾素α、β(IFN-α、β)和某些黏附分子等的表達，從而抑制細菌、病毒等病原體的感染。

本研究納入86例宮頸病變組織標本，其中包括41例宮頸癌、25例CINⅡ-Ⅲ、20例慢性宮頸炎組織，分別對其進行HPV基因型檢測、轉(zhuǎn)錄組測序和免疫組織化學(xué)染色分析。通過HPV基因型的檢測，發(fā)現(xiàn)宮頸癌、 CINⅡ-Ⅲ和慢性宮頸炎的HPV感染率分別為100%、60%、 15%。并在HPV陽性的標本中共檢測到11個HPV基因型，其中以HPV16為主要感染型別。并從中選取了15例宮頸病變組織進行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)HPV16陽性的宮頸癌和CINⅡ-Ⅲ組織中與TLR9相關(guān)的差異上調(diào)表達的基因有12個,其中就包括UBC和NF-κB，因此我們推測UBC和NF-κB是與HPV16感染相關(guān)的TLR9靶基因。再以良性病變慢性宮頸炎為對照，通過免疫組織化學(xué)篩查分析，發(fā)現(xiàn)TLR9、UBC和NF-κB在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌組織中呈不同程度的陽性表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此說明TLR9參與了宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的進程。且TLR9與UBC、NF-κB表達水平均呈正相關(guān)(r分別為0.510和0.469，P值均<0.001)。提示TLR9可能通過其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活UBC、NF-κB，并進一步通過NF-κB的下游靶基因的激活在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起作用。由此說明本研究進一步支持在宮頸癌發(fā)展過程中，HPV16感染可能通過泛素- 蛋白酶體降解途徑影響TLR9 蛋白表達，但其具體調(diào)控機制還需要深入研究。

目前，TLR9在宮頸癌中所介導(dǎo)的表達調(diào)控機制仍不明確，只有通過多種TLR相關(guān)的基因表達調(diào)控水平篩查分析，鑒別出宮頸癌特異性TLR信號通路，才能深入開展TLR介導(dǎo)的天然免疫與宮頸癌進程之間相互作用的機制研究。在此過程中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵信號分子也可為將來宮頸癌的藥物治療提供新的靶點。

[收稿日期：2018-02-27]

(本文編輯楊晨晨)