王同玫，張一奇，文普帥，畢竟，李錦成

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 乳腺外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001）

目前，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤之一，也是引起女性死亡的重要病因。最新數(shù)據(jù)顯示，每年全世界女性乳腺癌發(fā)病率為167萬(wàn)，其中發(fā)展中國(guó)家占52.9%[1]；在我國(guó)，乳腺癌發(fā)病率也逐年增多，且呈年輕化趨勢(shì)[2]。因乳腺癌的早期臨床癥狀不明顯，故多數(shù)患者首次診斷即已至中晚期。雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、抗細(xì)胞增殖核抗原（Ki-67）、抑癌基因p53、癌基因Her2/neu等分子標(biāo)志物的相繼發(fā)現(xiàn)，在一定程度上闡釋了乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，也為其精準(zhǔn)治療提供候選靶點(diǎn)。但由于腫瘤的異質(zhì)性，仍需進(jìn)一步探究在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的相關(guān)分子。

Disabled-1（Dab1）是細(xì)胞內(nèi)重要的銜接蛋白，由555個(gè)氨基酸組成，N端有蛋白相互作用/磷酸酪氨酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域P（I/PTB domain），可結(jié)合多個(gè)含NPxY的跨膜蛋白[3]，其基因位于染色體1p32.2的不穩(wěn)定區(qū)域，也就是基因修飾活躍和缺失區(qū)域；研究表明，在人類的腫瘤中Dab1低表達(dá)的情況并不少見，其異常表達(dá)于子宮內(nèi)膜癌，腦膠質(zhì)瘤中[4]。最近國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)[5]，該基因在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)降低，故推測(cè)該基因可能與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但有關(guān)該基因是如何在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起作用及其與乳腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系，尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）檢測(cè)乳腺癌組織中Dab1的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，從而為后續(xù)探究Dab1及其相關(guān)信號(hào)通路在乳腺癌中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月-2017年5月本院手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷確診為乳腺癌的50例石蠟包埋癌組織標(biāo)本。其中導(dǎo)管原位癌19例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌15例，黏液性癌4例，浸潤(rùn)性小葉癌3例，混合性（導(dǎo)管內(nèi)癌及小葉癌）9例；均為女性；年齡35～65歲。同時(shí)取50例距其癌組織3 cm的癌旁組織作對(duì)照。以上所用標(biāo)本均經(jīng)10%的中性甲醛固定石蠟包埋，所有患者在術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及免疫治療。

1.2 試劑與設(shè)備

一抗兔抗人Dab1抗體購(gòu)自Millipore公司，用于免疫組化的濃度為1∶100～1∶2 000，本實(shí)驗(yàn)選擇的濃度為1∶200；免疫組化試劑盒以及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。正置顯微鏡（德國(guó)Leica公司，4000b），超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司，Milli-Q Integral 3），高壓滅菌器（日本SANYO 公司，MLS-3780），溫箱（Thermo Scientific），不銹鋼高壓鍋。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。主要步驟：每例標(biāo)本取3張切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3%過氧化氫室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，雙蒸水洗3次；檸檬酸緩沖液（pH 6.0）高壓抗原修復(fù)，待切片自然冷卻至室溫，PBS洗3次；滴加山羊血清室溫封閉15 min；去除血清滴加Dab1一抗（用PBS稀釋比例為1∶200），濕盒中4℃冰箱過夜；取出過夜的切片恢復(fù)室溫，用PBS洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育15 min，PBS洗3次；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS洗3次；DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，若切片中發(fā)現(xiàn)棕黃色顯色立即自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)；顯色后的切片蘇木精復(fù)染5 min，1%濃鹽酸無(wú)水乙醇分化返藍(lán)，梯度酒精脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并判斷結(jié)果。

1.3.2 免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) Dab1表達(dá)主要為細(xì)胞核內(nèi)黃褐色沉淀，根據(jù)免疫組化反應(yīng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分[6]。首先將染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、黃褐色3分；再對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分：顯微鏡下選5個(gè)視野先低倍后高倍進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，算出5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比，然后進(jìn)行評(píng)分：陰性0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。最后將每張切片兩種評(píng)分相乘為其染色分?jǐn)?shù)：0分為陰性，1～3分為弱陽(yáng)性，4～6分為陽(yáng)性，＞8分為強(qiáng)陽(yáng)性。為方便統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性判定為陽(yáng)性表達(dá)；其他的均定義為陰性表達(dá)。

1.3.3 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)乳腺癌樣本中Dab1表達(dá)水平及生存分析 在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢Dab1表達(dá)譜，先限定（Analysis type：Breast cancer vs Normal analysis），再輸入基因名稱，即可檢索獲得各乳腺癌相關(guān)的數(shù)據(jù)集，P＜0.05的過濾選項(xiàng)；從GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）尋找并下載乳腺癌基因芯片GSE45255和GSE26971數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dab1蛋白在乳腺組織中的表達(dá)

Dab1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的棕黃色顆粒主要定位于細(xì)胞核中；Dab1蛋白在乳腺癌癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率84.0%（42/50）高于其在相應(yīng)的乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率 48.0%（24/50）（χ2=100.00，P =0.000）。見圖1。

2.2 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Dab1蛋白在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤分化程度的降低和腫瘤TNM分期的增高而增高（P＜0.05），無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）；而與患者的年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤的病理類型及腫瘤大小無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見附表。

2.3 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索乳腺癌中Dab1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：明顯下調(diào)（P＜0.05，見圖2A），進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果。另外，下載GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行Kaplan-Meier法分析，結(jié)果顯示：Dab1高表達(dá)的乳腺癌患者比低表達(dá)的患者生存時(shí)間長(zhǎng)，提示Dab1可作為判斷乳腺癌預(yù)后的分子指標(biāo)（見圖2B）。

圖1 Dab1在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖2 乳腺癌組織中Dab1蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

附表 臨床病理特征與Dab1蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著女性的健康。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多途徑的復(fù)雜過程，相關(guān)分子標(biāo)志物的相繼出現(xiàn)雖然在一定程度上為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供靶點(diǎn)，但由于腫瘤的異質(zhì)性，仍需進(jìn)一步去探究在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用的相關(guān)分子。Dab1基因是近年發(fā)現(xiàn)的一種基因，其在發(fā)育腦組織中高表達(dá)[7]，可介導(dǎo)Reelin信號(hào)參與調(diào)控細(xì)胞骨架，進(jìn)而影響神經(jīng)元的遷移和定位[8]。還有文獻(xiàn)報(bào)道[9]：該基因位于1個(gè)大的基因組不穩(wěn)定區(qū)域，即普通型脆性位點(diǎn)（common fragile sites，CFS），該區(qū)域的基因易發(fā)生缺失。因此，許多CFS基因，如PARK2、FHIT及WWOX等，在腫瘤中呈抑制的狀態(tài)，其中WWOX和FHIT已被證實(shí)為抑癌基因，其表達(dá)水平的下調(diào)與腫瘤患者不良預(yù)后呈正相關(guān)[10-12]。因此，定位于該區(qū)域的Dab1基因是否也有抑癌基因的作用值得深入探究。已有研究表明該蛋白在子宮內(nèi)膜癌和腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常，但其在乳腺癌組織中表達(dá)情況及其對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用并不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dab1蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)降低，其在乳腺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率低于其在癌旁組織的表達(dá)（P＜0.05）；同時(shí)，腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果提示，與癌旁組織比較，Dab1 mRNA的表達(dá)水平在乳腺癌組織中是降低的，這也從側(cè)面提示Dab1表達(dá)的減低可能與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。為進(jìn)一步了解Dab1在哪些類型的乳腺癌中低表達(dá)，筆者分析該蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分化程度的降低，Dab1蛋白表達(dá)隨之減少，隨著腫瘤TNM分期越晚，Dab1蛋白表達(dá)就越低，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中Dab1的陽(yáng)性表達(dá)率低于其在癌旁組織中的表達(dá)，而Dab1的經(jīng)典作用為介導(dǎo)Reelin信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞骨架而影響神經(jīng)元的遷移和定位，眾所周知，眾多異常表達(dá)的細(xì)胞骨架調(diào)控分子，如EZRIN[13]、IQGAP1[14]在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，故在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中Dab1的陽(yáng)性率降低更多可能與Dab1參與細(xì)胞遷移，從而負(fù)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān)。此外，Dab1蛋白表達(dá)與乳腺癌患者的年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤的病理類型及大小無(wú)關(guān)。由此可見，腫瘤的分化程度越低，TNM分期越晚、惡性程度越高的乳腺癌，Dab1的表達(dá)越低，故推測(cè)乳腺癌的發(fā)病中該基因的低表達(dá)可能發(fā)生在疾病的晚期階段。曹讓娟等[5]的研究表明，Dab1對(duì)正常細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用，故認(rèn)為其可能是1個(gè)潛在的抑癌組織，有望成為乳腺癌治療的1個(gè)新靶點(diǎn)。而且Kaplan-Meier生存分析提示，Dab1高表達(dá)的患者總生存率高于低表達(dá)者（P=0.044），說明Dab1的表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，提示其可能成為乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，Dab1在乳腺癌組織中低表達(dá)，與患者的腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。因此，Dab1有可能成為乳腺癌惡性程度判斷、預(yù)后評(píng)估和治療的有效生物標(biāo)志物，但是由于臨床研究樣本數(shù)太少，還需要大量臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]REBECCA L S, KIMBERLY D M, AHMEDIN J, et al. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1): 5-29.

[2]易琳, 劉興明, 林丁, 等. 血清CA153,CA125,CEA聯(lián)合檢測(cè)在乳腺癌診斷中的價(jià)值[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 37(9): 802-805.

[3]TISSIR F, GOFFINET A M. Reelin and brain development[J]. Nat Rev Neurosci, 2003, 4(6): 496-505.

[4]MCAVOY S, ZHU Y, PEREZ D S, et al. Disabled-1 is a large common fragile site gene, inactivated in multiple cancers[J]. Genes Chromosomes Cancer 2008, 47(2): 165-174.

[5]曹讓娟, 李凱, 邢琬瑩, 等. Disabed-1在人乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2016,42(5): 932-936.

[6]許良中. 免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中國(guó)癌癥雜志,1996, 6(4): 230-231.

[7]TROTTER J, LEE G H, KAZDOBA T M, et al. Dab1 is required for synaptic plasticity and associative learning[J]. Neurosci, 2013,33(39): 15652-15668.

[8]CHAI X, FORSTER E, ZHAO S, et al. Reelin stabilizes the actin cytoskeleton of neuronal processes by inducing n-cofilin phosphorylation at serine[J]. Neurosci, 2009, 29(1): 288-299.

[9]MCAVOY S, ZHU Y, PEREZ D S, et al. Disabled-1 is a large common fragile site gene, inactivated in multiple cancers[J]. Gene Chromosome Cancer, 2008, 47(2): 165-174.

[10]GARDENSWARTZ A, AQEILAN R I. WW domain-containing oxidoreductase’s role in myriad cancers: clinical significance and future implications[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2014, 239: 253-263.

[11]GAO G, KASPERBAUER J L, TOMBERS N M, et al. A selected group of large common fragile site genes have decreased expression in oropharyngeal squamous cell carcinomas[J]. Genes Chromosome Cancer, 2014, 53(5): 392-401.

[12]GAO G, SMITH D I, WWOX, large common fragile site genes,and cancer[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2015, 240(3): 285-295.

[13]劉洋, 王軍, 李愛東, 等. Ezrin蛋白的生物學(xué)作用及其與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 15(13): 2551-2580.

[14]王夏煒, 曹永倩, 張芮. 支架蛋白IQGAP1與腫瘤研究現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志, 2014, 21(20): 1657-1661.