肖漪，彭子荷，孫悅，劉嘉祺，王路，郭靈麗，郝小惠，劉和亮，王宏麗（華北理工大學 .醫(yī)學實驗研究中心，.公共衛(wèi)生學院，河北 唐山063000）

依達拉奉是一種自由基清除劑，臨床上，依達拉奉主要用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，對急性腦梗死、腦出血等疾病顯示出了良好的腦保護作用，由于其治療譜廣，近年來已經(jīng)將其擴展到心臟、肝臟或胃腸道等疾病的治療[1]。矽肺又稱硅肺，是由于長期吸入大量游離二氧化硅粉塵所引起的以肺部廣泛的結節(jié)性纖維化為主的疾病[2]。有文獻報道自由基損傷可能是矽肺發(fā)病的一個重要環(huán)節(jié)[5-6]，因此本研究擬觀察依達拉奉對矽肺大鼠的治療作用及對自由基的影響，以期為臨床應用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康無特定病原體級（SPF）級雄性Wistar大鼠54只，體重180～220 g。二氧化硅（SiO2）粉塵（由河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點實驗室提供，純度99%，粒子直徑在0.5～10.0 μm，經(jīng)研磨、烘烤后，用生理鹽水配成50 mg/ml濃度粉塵懸液，高壓滅菌后，4℃儲存?zhèn)溆茫?，還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH），羥脯氨酸（hydroxyproline, HYP）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）試劑盒（購自南京建成生物工程研究所），兔抗GAPDH（購自于美國Cell Signaling公司），兔抗TGF-β（購于英國Abcam公司），依達拉奉[購自輝南長龍生化藥業(yè)股份公司（國藥準字號 ：H20080592）]。

1.2 方法

1.2.1 分組造模與標本制備 將54只大鼠稱重、編號，隨機分為3組：對照組、模型組及依達拉奉干預組，對照組6只，模型組和依達拉奉干預組各24只。適應性飼養(yǎng)1周后，模型組和依達拉奉干預組大鼠采用非暴露法氣管內一次性注射SiO2懸液（250 mg/kg）復制矽肺模型[3-4]，依達拉奉干預組在注射SiO2懸液第2天后開始腹腔注射依達拉奉4 ml/（kg·d）。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)28 d。模型與依達拉奉干預組大鼠分別在7、14、21及28 d后處死，取右肺下葉組織進行HE染色，左肺組織用于GSH和轉化生長因子β（transform growth factor -beta, TGF-β）含量測定，右肺上葉組織用于HYP測定，右肺中葉用于MDA測定。

1.2.2 肺組織中HYP、GSH、MDA含量測定 樣品制備后嚴格按照試劑盒說明書進行測定。HYP（μg/mg）=（測定管吸光度值-空白管吸光度值）/（標準管吸光度值-空白管吸光度值）×標準品含量 （5 μg/ml）×水解液總體積（10 ml）/組織濕重（50 mg）。

1.2.3 Wester n blot檢測肺組織TGF-β蛋白表達腹腔注射28 d后，取各組大鼠肺組織，經(jīng)蛋白裂解液裂解組織后提取組織總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白質濃度測定，取30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）約1.5 h，轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃過夜，TBST清洗，抗兔單克隆抗體anti-TGF-β（1∶1 200），室溫搖床孵育4 h，稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000），37℃孵育2 h，電化學發(fā)光（ECL）顯色后用掃描儀進行掃描，經(jīng)Alpha View自動圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集和定量分析Tgf-β蛋白的表達，同時以內參GAPDH（1∶2 000）進行對照。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織形態(tài)學觀察結果

光鏡下觀察，可見對照組大鼠肺組織結構清晰，肺泡腔內未見炎癥細胞，肺泡間隔正常；模型組大鼠染塵后7 d出現(xiàn)如肺泡壁水腫，炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增寬增厚，彌漫性膠原纖維沉積等病理改變；隨時間增加，組織結構破壞程度更為嚴重，證實大鼠矽肺模型復制成功。依達拉奉干預組病變特征與模型組相似，但肺組織膠原沉積減少，肺泡結構基本存在，尤其是在給藥21 d后改善較明顯。見圖1。

2.2 肺組織HYP、GSH和MDA含量變化

對9組HYP、GSH和MDA的比較行方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=88.190、59.102及17.135，均P=0.000）。模型組和依達拉奉干預組的HYP、GSH與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），依達拉奉干預組HYP、GSH含量與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣與對照組比較，模型組MDA增高（P＜0.05），而依達拉奉干預組先升高后降低，21 d后與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義，同時各時間MDA含量均低于模型組（P＜0.05）。見表1。

2.3 肺組織TGF-β蛋白表達

Western blot檢測結果（見圖2和表2）顯示，對9組TGF-β進行方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=49.766，P=0.000）。模型組和依達拉奉干預組大鼠肺組織中TGF-β蛋白表達量均高于對照組（P＜0.05），而依達拉奉干預組各時間比模型組TGF-β 蛋白表達降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學變化 （HE×200）

表1 大鼠不同時間段肺組織HYP、GSH和MDA的含量變化 （±s）

表1 大鼠不同時間段肺組織HYP、GSH和MDA的含量變化 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 例數(shù) HYP/（μg/mg） GSH/u MDA/（nmol/mg prot）對照組 6 0.498±0.058 5.436±0.981 0.461±0.234模型組7 d 6 0.914±0.1041） 1.519±0.2081） 2.736±0.6361）14 d 6 1.060±0.1151） 1.844±0.2841） 2.256±0.3261）21 d 6 1.533±0.1701） 1.486±0.4241） 2.038±0.5531）28 d 6 1.889±0.1461） 1.663±0.3451） 1.752±0.2161）依達拉奉干預組7 d 6 0.681±0.1401）2） 2.222±0.1271）2） 1.798±0.4881）2）14 d 6 0.825±0.0481）2） 3.273±0.4211）2） 1.295±0.3511）2）21 d 6 0.845±0.1021）2） 3.685±0.4631）2） 0.926±0.3572）28 d 6 0.921±0.0711）2） 4.550±0.3701）2） 0.871±0.4062）

圖2 肺組織TGF-β蛋白表達

表2 肺組織TGF-β蛋白表達比較 （±s）

表2 肺組織TGF-β蛋白表達比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05;2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 例數(shù) TGF-β對照組 6 0.360±0.167模型組7 d 6 2.824±0.2321）14 d 6 4.240±0.4601）21 d 6 3.733±0.6291）28 d 6 3.254±0.5551）依達拉奉組7 d 6 1.328±0.0811）2）14 d 6 1.686±0.7401）2）21 d 6 1.583±0.3781）2）28 d 6 1.218±0.4131）2）

3 討論

近年來的研究證實，自由基在SiO2引起的肺纖維化方面起著關鍵性的作用[7]。石英等顆粒在粉碎過程中自身可產(chǎn)生自由基，當肺巨噬細胞（alveolar macrophage, AM）吞噬石英和游走時引起呼吸爆發(fā)可產(chǎn)生大量自由基，髓單核細胞在肺中轉化為AM后被活化時還可產(chǎn)生氮氧自由基，導致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡。自由基作用于AM，產(chǎn)生脂質過氧化導致質膜損傷，進而分泌多種細胞因子，誘導纖維細胞增生和膠原合成，造成肺纖維化。自由基還可以作用于肺內其他生物基質和對免疫功能發(fā)生影響，促進肺纖維化過程[8]。

依達拉奉是目前廣泛被認可的自由基清除劑[9]，于2001年4月在日本首次上市。有相關研究顯示，其對自由基毒性損傷具有強大的抑制作用[10-11]。本研究探索應用依達拉奉治療矽肺大鼠，結果發(fā)現(xiàn)應用依達拉奉后矽肺大鼠體內反映自由基生成程度的MDA降低，而反映體內抗氧化系統(tǒng)的重要因子GSH活力提高[12]，提示依達拉奉在矽肺發(fā)病過程中起到抗自由基作用。

在矽肺纖維化過程中，TGF-β是其中最重要的促纖維化因子[13]。本研究結果顯示，隨著時間的進展，模型組TGF-β蛋白含量先增高后降低，符合相關文獻中的趨勢[14]；HYP能反映膠原增加及膠原代謝的狀況[15]，測定肺組織中HYP的水平，可直接反映肺成纖維細胞合成膠原的能力。本研究結果發(fā)現(xiàn)，應用依達拉奉后TGF-β和HYP相對矽肺模型組減少，提示依達拉奉可以有效降低矽肺纖維化程度。

綜上所述，依達拉奉可有效降低矽肺大鼠體內的自由基水平，同時可使自身的抗氧化系統(tǒng)得到一定的恢復，因而降低矽肺纖維化程度，使矽肺大鼠的癥狀得到改善從而起到治療作用。但其降低自由基水平干預矽肺纖維化進程的具體機制還需要進一步探討。

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