劉芳，桂定清，張力憶

（四川省達(dá)州市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 達(dá)州 635000）

宮頸癌為常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要原因[1]，探明其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制有助于開(kāi)展靶向性治療以提升預(yù)后。目前研究證實(shí)，細(xì)胞黏附能力的喪失可能導(dǎo)致細(xì)胞連接的破壞，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[2]，上皮細(xì)胞的黏附主要依靠黏附連接和緊密連接，Claudin蛋白是緊密連接的重要密閉蛋白[3]。已有報(bào)道[4-5]證實(shí)，多種Claudin蛋白在包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥組織中表達(dá)量增加，且有研究[6]證實(shí)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本文研究EGF對(duì)宮頸癌細(xì)胞緊密連接蛋白3（Claudin-3）表達(dá)的影響及該影響的形成機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

主要材料：人宮頸癌Hela細(xì)胞株[購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）]。主要試劑：EGF（購(gòu)自美國(guó)Peprotech），總RNA提取試劑盒（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen），總蛋白提取試劑盒（購(gòu)自上海偉進(jìn)），PCR試劑盒（購(gòu)自日本TaKaRa），磷酸酶抑制劑、EGF受體（EGF receptor，EGFR）阻斷劑（ZD1839）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3-K）阻斷劑（LY294002及Wortmannin）、促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）阻斷劑（PD98059及 U0126）、p38阻斷劑（SB203580）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）阻斷劑（SP600125）（均購(gòu)自美國(guó)Sigma），Western blot試劑盒（購(gòu)自北京中山金橋），PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 前期細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞株接種于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合后，消化并將細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板，同樣條件下培養(yǎng)24 h，達(dá)到貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)。去除培養(yǎng)基，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，開(kāi)展后續(xù)處理。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)路徑 所培養(yǎng)的Hela細(xì)胞分別用于開(kāi)展3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，且各項(xiàng)研究均設(shè)3個(gè)復(fù)組：①分別加入含 有 EGF終 濃 度 0.0、0.5、5.0、10.0、100.0 ng/ml的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)8 h，搜集細(xì)胞，檢測(cè)Claudin-3蛋白及信使RNA（messenger RNA, mRNA）的表達(dá)情況；②加入含有EGF終濃度10 ng/ml的DMEM培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h，搜集細(xì)胞，檢測(cè)不同時(shí)間Claudin-3蛋白及mRNA的表達(dá)情況和EGFR、蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2, ERK1/2）、p38、JNK磷酸化情況；③分別加入不含任何阻斷劑、含ZD1839終濃度10 nmol/L、含LY294002終濃度20 nmol/L、含Wortmannin終濃度5 nmol/L、含PD98059終濃度20 nmol/L、含U0126終濃度10 nmol/L、含SB203580終濃度10 nmol/L、含SP600125終濃度10 nmol/L的DMEM中培養(yǎng)1 h，再加入終濃度為10 ng/ml的EGF培養(yǎng)后，搜集細(xì)胞，測(cè)評(píng)各阻斷劑特異性阻斷效果和Claudin-3蛋白及其mRNA的表達(dá)情況。

1.2.3 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反 應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)Claudin-3 mRNA表達(dá)情況。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：55℃水浴40 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min。反應(yīng)體系 ：PCR Mater Mix 10 μl、cDNA模板5 μl，正向及反向引物20 nmol/L，無(wú)菌水定容至20 μl。檢測(cè)結(jié)果采用2-△△Ct表示。

1.2.4 蛋白水平檢測(cè) 采用Western bolt法檢測(cè)各蛋白水平。搜集細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，取各樣本總蛋白50 μg，將體系混勻后，加熱煮沸5～10 min，立即置于冰上，完全冷卻后瞬間離心，上樣，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗，加入DAB底物顯色液，獲得并分析凝膠圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Claudin-3 mRNA檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

接種至6孔板后，培養(yǎng)至24 h，細(xì)胞貼壁良好，可基本覆蓋孔壁，且細(xì)胞存活率高，經(jīng)顯微鏡觀察，其細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或不規(guī)則狀，且細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)特性，連接緊密。見(jiàn)圖1。

2.2 不同終濃度EGF對(duì)Claudin-3蛋白及mRNA表達(dá)的影響

總體分析顯示，不同終濃度處理后，Hela細(xì)胞中Claudin-3蛋白及mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。經(jīng)兩兩比較，顯示且以10 ng/ml終濃度EGF處理，上調(diào)幅度最大。見(jiàn)表2和圖2。

2.3 10 ng/ml EGF處理后Claudin-3蛋白及mRNA不同時(shí)間表達(dá)情況

處理24 h后，Claudin-3蛋白表達(dá)增加（t=75.685，P=0.000）；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Claudin-3 mRNA表達(dá)呈上升趨勢(shì)（F時(shí)間=157.114，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

2.4 EGF對(duì)EGFR、AKT、ERK1/2、p38和JNK磷酸化的影響

驗(yàn)證顯示，EGF處理后，Hela細(xì)胞內(nèi)EGFR、AKT、ERK1/2、p38和JNK均出現(xiàn)磷酸化現(xiàn)象，且AKT、JNK磷酸化在處理30 min最明顯，EGFR、ERK1/2、p38磷酸化在處理10 min最明顯。見(jiàn)表3。

2.5 信號(hào)阻斷劑對(duì)EGFR、AKT、ERK1/2、p38及JNK磷酸化的影響

驗(yàn)證顯示，ZD1839能夠特異性阻斷EGFR磷酸化；LY294002、wortmannin能夠特異性阻斷AKT磷酸化；PU98059、U0126能夠特異性阻斷ERK1/2磷酸化；SB203580能夠特異性阻斷p38磷酸化；SP600125能夠特異性阻斷JNK磷酸化。

2.6 各信號(hào)通路阻斷對(duì)Claudin-3蛋白表達(dá)的影響

阻斷EGFR、AKT、ERK1/2、p38及JNK磷酸化后，經(jīng)10 ng/ml EGF干預(yù)24 h后，Claudin-3蛋白表達(dá)均受到抑制（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

表2 不同終濃度EGF處理后Claudin-3蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表2 不同終濃度EGF處理后Claudin-3蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：?與其他濃度比較，P ＜0.05

EGF終濃度F值 P值0 ng/ml 0.5 ng/ml 5.0 ng/ml 10.0 ng/ml 100.0 ng/ml Claudin-3蛋白 0.452±0.056 0.782±0.067 0.978±0.056 1.429±0.073? 1.051±0.103 72.516 0.000 Claudin-3 mRNA 0.113±0.036 0.403±0.016 1.198±0.054 3.174±0.165? 2.707±0.098 676.418 0.000指標(biāo)

圖2 不同終濃度EGF處理后Claudin-3蛋白及mRNA表達(dá)情況

圖3 10 ng/ml EGF處理后Claudin-3蛋白及mRNA不同時(shí)間表達(dá)情況

表3 EGF處理后EGFR、AKT、ERK1/2、p38及JNK磷酸化情況 （±s）

表3 EGF處理后EGFR、AKT、ERK1/2、p38及JNK磷酸化情況 （±s）

注：?與其他時(shí)間比較，P ＜0.05

?

圖4 各信號(hào)通路阻斷對(duì)Claudin-3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預(yù)后的重要因素，目前研究顯示細(xì)胞間黏附力的喪失可導(dǎo)致細(xì)胞連接破壞，為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[7]，Claudins是形成緊密連接的主要骨架[8]，其表達(dá)的上調(diào)或下降均可導(dǎo)致緊密連接的重組，CUNNIFFE等[9]報(bào)道指出Claudin-1、Claudin-7單一過(guò)表達(dá)不增加宮頸癌發(fā)生率，但均過(guò)表達(dá)可能預(yù)示宮頸惡性病變，同時(shí)兩者過(guò)表達(dá)有助于抑制Hela細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，針對(duì)性研究Claudin-3與宮頸癌相關(guān)性的報(bào)道較少，但針對(duì)乳腺癌[10]、胃癌等[11]惡性腫瘤的報(bào)道提示其過(guò)表達(dá)可能與腫瘤惡性程度正相關(guān)，本研究則發(fā)現(xiàn)Cluadin-3在宮頸癌Hela細(xì)胞系中也存在高表達(dá)現(xiàn)象，這與Claudin-3生物學(xué)作用有關(guān)，其能促進(jìn)細(xì)胞受體二聚化，并使細(xì)胞質(zhì)位點(diǎn)磷酸化而與多種不同信號(hào)序列蛋白結(jié)合而促使信號(hào)傳導(dǎo)。大量研究證實(shí)EGFR在宮頸癌等惡性腫瘤細(xì)胞中存在過(guò)表達(dá)，其活化后能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、增殖及腫瘤血管的形成[12-13]，但該過(guò)程是否有Claudin-3的參與，及EGFR對(duì)Claudin-3的調(diào)節(jié)機(jī)制，目前尚未完全明確，本研究則有助于解決該問(wèn)題。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGF在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，均誘導(dǎo)Hela細(xì)胞上調(diào)Claudin-3的表達(dá)，且該作用存在時(shí)間和濃度依賴型，說(shuō)明EGFR信號(hào)通路能夠影響Claudin-3的表達(dá)，可能是EGFR過(guò)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤惡性化程度升高的機(jī)制之一，ZHANG等[14]針對(duì)肺癌的病例研究有類似結(jié)論。EGFR的主要下游信號(hào)涉及MAPK和PI3-K通路，其中前者又包括ERK1/2、p38和JNKs等不同類型[15]，本研究應(yīng)用相應(yīng)阻斷劑阻斷EGFR下游信號(hào)通路，EGF處理后，Hela細(xì)胞內(nèi)EGFR、AKT、ERK1/2、p38及JNK均出現(xiàn)磷酸化現(xiàn)象，提示Hela細(xì)胞中EGFR信號(hào)通路激活后，各下游通路均被激活，經(jīng)阻斷劑預(yù)處理則能夠特異性阻斷對(duì)應(yīng)下游通路的激活，說(shuō)明研究方案是可行的。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR對(duì)Claudin-3的調(diào)節(jié)作用與AKT、ERK1/2、p38及JNK信號(hào)通路均有關(guān)，這說(shuō)明在Hela細(xì)胞中，EGFR能夠通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)Claudin-3的表達(dá)，de SOUZA WF等[16]針對(duì)結(jié)直腸癌的報(bào)道也提示ERK1/2、PI3-K/AKT信號(hào)通路能夠影響Claudin-3的表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力；LI等[17]報(bào)道則顯示p38通路也可影響Claudins蛋白的表達(dá)；其他亦有研究[18]提示，JNK信號(hào)通路與Claudin-3表達(dá)有關(guān)?？梢?jiàn)，由于EGFR多個(gè)下游信號(hào)通路均可影響Claudin-3的表達(dá)，可能難以通過(guò)對(duì)單一下游信號(hào)通路的阻斷抑制Claudin-3的表達(dá)，進(jìn)而提升患者預(yù)后，直接干預(yù)上游信號(hào)通路可能是更好的解決方案。

綜上所述，本研究顯示EGF能夠增加Hela細(xì)胞Claudin-3的表達(dá)，其機(jī)制可能涉及EGFR、PI3-K、MAPK、p38及JNK信號(hào)通路。

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