張?，摚跽鹩?，孔祥沙，季穎，朱凌，魏來(lái)

[北京大學(xué)人民醫(yī)院 北京大學(xué)肝病研究所（丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），北京 100044]

甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）感染及所導(dǎo)致的疾病成為我國(guó)嚴(yán)重的社會(huì)公共衛(wèi)生問題[1]。我國(guó)屬于甲型肝炎的高發(fā)區(qū)，HAV感染可導(dǎo)致肝衰竭甚至死亡[2]。人感染HAV后多表現(xiàn)為亞臨床癥狀，檢測(cè)性能好的HAV診斷試劑，對(duì)HAV的防治尤為重要。HAV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括HAV-IgM和HAV-IgG兩種抗體。HAV-IgG陽(yáng)性表明患者既往感染過HAV，HAV-IgM是用于診斷HAV新近感染的血清學(xué)標(biāo)志[3]。近年來(lái)HAV檢測(cè)試劑已得到廣泛應(yīng)用，但關(guān)于不同HAV-IgM檢測(cè)試劑的敏感性如何？目前相關(guān)研究較少。為加強(qiáng)HAV抗體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的質(zhì)量控制，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及為甲肝抗體人群血清流行病學(xué)調(diào)查選擇試劑提供參考，本文旨在全面評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上應(yīng)用較廣的2種HAV-IgM檢測(cè)試劑，并探討其原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年5月-2017年6月該院就診的疑似急性HAV感染門診和住院患者血清樣本196例。其中，男性108例，女性88例；年齡11～84歲，中位43歲?；颊呔D(zhuǎn)氨酶異常升高或伴有黃疸，且均排除乙型、丙型、丁型及戊型肝炎病毒感染。

1.2 試劑與儀器

HAV-IgM檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒[化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法（chemiluminesent microparticle immuno assay, CMIA），批號(hào)：72366LI00、配套儀器為ARCHITECT i2000SR，美國(guó)雅培公司，S/CO為0.00～0.79]。當(dāng)S/CO≤0.79，儀器報(bào)告結(jié)果判為陰性；S/CO為0.80～1.20是HAV-IgM試劑檢測(cè)灰區(qū)；當(dāng)S/CO≥1.21，儀器報(bào)告結(jié)果判為陽(yáng)性。萬(wàn)泰甲型肝炎病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒[酶聯(lián)免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）]，批號(hào)：AM20170609，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，陽(yáng)性對(duì)照吸光度值（optical delnsity, OD）平均值≥0.80，陰性對(duì)照OD值平均值≤0.10，樣本臨界值（Cut-off）=陰性對(duì)照孔OD均值×2.1，凡樣本OD值＞Cut-off值為陽(yáng)性。北京高達(dá)甲型肝炎病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒（ELISA），批號(hào)：201707006，北京現(xiàn)代高達(dá)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，陽(yáng)性對(duì)照OD值平均值≥1.00，陰性對(duì)照OD值平均值≤0.10，Cut-off=0.7116，凡樣本OD值＞Cut-off值為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析，一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種HAV-IgM敏感性和特異性

雅培HAV-IgM陽(yáng)性35例，萬(wàn)泰HAV-IgM陽(yáng)性58例，高達(dá)HAV-IgM陽(yáng)性48例。以雅培HAV-IgM檢測(cè)試劑為金標(biāo)準(zhǔn)，萬(wàn)泰和高達(dá)HAV-IgM的敏感性、特異性。見表1。

萬(wàn)泰、高達(dá)試劑與雅培檢測(cè)HAV-IgM有檢測(cè)結(jié)

表1 兩種HAV-IgM試劑檢測(cè)性能分析 %

果不一致的標(biāo)本，其中1例雅培HAV-IgM陽(yáng)性但其S/CO值較低（1.30～1.47），萬(wàn)泰和高達(dá)HAV-IgM均陰性；1例雅培HAV-IgM陽(yáng)性，高達(dá)HAV-IgM陽(yáng)性，萬(wàn)泰HAV-IgM陰性；4例雅培HAV-IgM灰區(qū)（0.80～1.20），萬(wàn)泰HAV-IgM陽(yáng)性但S/CO值較低（0.50～1.10），高達(dá)HAV-IgM陽(yáng)性但S/CO值較低（0.80～1.10）；5例雅培HAV-IgM陰性，萬(wàn)泰HAVIgM陽(yáng)性，其中4例S/CO值較低（均＞1.00），高達(dá)HAV-IgM陽(yáng)性但S/CO值為弱陽(yáng)性（0.75～1.00）；14例雅培HAV-IgM陰性，高達(dá)HAV-IgM陰性，萬(wàn)泰HAV-IgM陽(yáng)性。

2.2 兩種HAV-IgM S/CO值相關(guān)性

萬(wàn)泰和雅培試劑檢測(cè)HAV-IgMS/CO值相關(guān)（r=0.597，P=0.000）；高達(dá)和雅培試劑檢測(cè)HAVIgMS/CO 值相關(guān)（r=0.541，P=0.000）。見圖1、2。

圖1 萬(wàn)泰和雅培試劑檢測(cè)HAV-IgM S/CO值相關(guān)性

圖2 高達(dá)和雅培試劑檢測(cè)HAV-IgM S/CO值相關(guān)性比較

2.3 兩種HAV-IgM檢測(cè)試劑一致性比較

Kappa系數(shù)解釋如下，＜0.00：沒有一致性；0.00～0.19：極低的一致性；0.20～0.39：一般的一致性；0.40～0.59：中等的一致性；0.60～0.79：高度的一致性；0.80～1.00：幾乎完全一致。萬(wàn)泰HAV-IgM檢測(cè)試劑與雅培HAV-IgM試劑高度一致（K=0.648，P=0.000）；高達(dá)HAV-IgM檢測(cè)試劑與雅培HAV-IgM檢測(cè)試劑高度一致（K=0.772，P=0.000）。見表2。

表2 兩種HAV-IgM試劑一致性比較

3 討論

甲型肝炎是世界范圍內(nèi)最常見的急性病毒性肝炎[4]，為許多國(guó)家嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[5]。它主要經(jīng)糞-口途徑傳播，通過污染水源、食物及食具等廣泛流行[6-10]，也可通過器官移植傳播[11]。甲型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括ELISA、CMIA及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（electro chemi luminescence immuno assay，ECLIA）檢測(cè)血清中HAV-IgM。雅培全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀利用化學(xué)發(fā)光原理結(jié)合免疫技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，具有敏感性好、特異性高及受干擾小的特點(diǎn)，與其他電化學(xué)發(fā)光免疫分析法有相關(guān)性，在臨床檢驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用，是公認(rèn)的臨床檢測(cè)HAV-IgM金標(biāo)準(zhǔn)[12-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高達(dá)試劑的敏感性、特異性均高于萬(wàn)泰試劑，高達(dá)試劑和萬(wàn)泰試劑均有較高的陰性預(yù)測(cè)值。研究還發(fā)現(xiàn)萬(wàn)泰、高達(dá)試劑與雅培HAV-IgM試劑S/CO值均有相關(guān)性；萬(wàn)泰、高達(dá)試劑與雅培試劑均有高度的一致性。說(shuō)明兩種試劑均有很好的診斷性和可靠性，為臨床檢測(cè)試劑的選擇提供更多的依據(jù)。國(guó)內(nèi)外研究對(duì)臨床常用的甲型肝炎檢測(cè)方法進(jìn)行比較，黃嫵姣等[15]比較瑞士羅氏公司的ECLIA方法和上海科華生物工程股份有限公司的ELISA方法檢測(cè)HAV-IgM，發(fā)現(xiàn)兩種檢測(cè)結(jié)果的一致性較低。該研究使用ECLIA方法不同于筆者研究的雅培CMIA方法以及ELISA。HYEWON等[12]比較雅培CMIA、羅氏ECLIA及德國(guó)西門子公司的ADVIA Centaur全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)HAV-IgM，發(fā)現(xiàn)3種方法有高度的一致性，對(duì)16例檢測(cè)不一致的結(jié)果，雅培試劑顯示灰區(qū)，其他兩種方法均為陰性。

兩種試劑盒在檢測(cè)IgM低水平患者標(biāo)本時(shí)，出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況，不排除有假陽(yáng)性或假陰性的可能，是臨床檢測(cè)、臨床診斷及人群血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)選擇檢測(cè)試劑需注意的問題。黃嫵姣等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ELISA法檢驗(yàn)敏感性高，但易出假陽(yáng)性，羅氏ECLIA特異性好，檢測(cè)結(jié)果更符合臨床。本研究發(fā)現(xiàn),雖然兩種檢測(cè)HAV-IgM試劑有不一致結(jié)果，但兩種試劑檢測(cè)的S/CO值有相關(guān)性。但HYEWON等[12]比較雅培CMIA、羅氏ECLIA及西門子ADVIA Centaur檢測(cè)HAV-IgM的S/CO值有相關(guān)性。

萬(wàn)泰、高達(dá)試劑均采用ELISA法檢測(cè)HAV-IgM。ELISA法檢測(cè)HAV-IgM假陽(yáng)性的主要原因：①類風(fēng)濕因子，自身免疫性疾病及腎衰竭等的干擾，都可導(dǎo)致HAV-IgM假陽(yáng)性[16-17]；②標(biāo)本性狀的影響，標(biāo)本溶血、乳糜血或分離血清不徹底而使血清中含有纖維蛋白原影響檢測(cè)結(jié)果引起假陽(yáng)性。為降低檢測(cè)假陽(yáng)性率，可增大標(biāo)本離心轉(zhuǎn)速（3 000 r/min），延長(zhǎng)標(biāo)本離心時(shí)間，使抗凝血標(biāo)本得以徹底離心分離。ELISA法洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗板針無(wú)纖維蛋白或異物堵塞，將洗液注滿各反應(yīng)孔，防止產(chǎn)生假陽(yáng)性[18]。

綜上所述，國(guó)內(nèi)常用的兩種HAV-IgM檢測(cè)試劑盒有很好的檢測(cè)性和一致性，可在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用，為HAV診斷提供有力的支持，防止甲型肝炎流行。但在部分IgM水平較低的患者中，兩種抗體檢測(cè)試劑會(huì)存在不一致的結(jié)果，對(duì)這一部分結(jié)果還有待進(jìn)一步研究，應(yīng)是臨床檢測(cè)、臨床診斷及人群血清流行病學(xué)調(diào)查時(shí)選擇參考試劑需要注意的問題。進(jìn)一步研發(fā)HAV-IgM的定量試劑有助于診斷不典型的HAV感染及移植后的HAV再激活。

[1]寧桂軍, 程萱芹, 陳園生, 等. 貴州省旱災(zāi)期間一起甲型病毒性肝炎爆發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)疫苗和免疫, 2013, 19(5):435-438.

[2]BOSE M, BOSE S, SAIKIA A, et al. Molecular epidemiology of hepatitis A virus infection in Northeast India[J]. J Med Virol, 2015,87(7): 1218-1224.

[3]BARZAGA B N. Hepatitis A shifting epidemiology in South-East Asia and China[J]. Vaccine, 2000, 18(Suppl 1): S61-S64.

[4]FRANCO E, MELELEO C, SERINO L, et al. Hepatitis A:epidemiology and prevention in developing countries[J]. World J Hepatol, 2012, 4(3): 68-73.

[5]LIMA L R, DE ALMEIDAl A J, TOURINHO RDOS S, et al.Evidence of hepatitis A virus person-to-person transmission in household outbreaks[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e102925.

[6]NEFFATTI H, LEBRAUD P, HOTTELET C, et al. Southern Tunisia: A still high endemicity area for hepatitis A[J]. PLoS One,2017, 12(4): e0175887.

[7]SEVERI E, VENNEMA H, TAKKINEN J, et al. Hepatitis A outbreaks[J]. Lancet Infect Dis, 2015, 15(6): 632-634.

[8]CHI H, HAAGSMA E B, RIEZEBOS-BRILMAN A, et al. Hepatitis A related acute liver failure by consumption of contaminated food[J]. J Clin Virol, 2014, 61(3): 456-458.

[9]SHIN E, KIM J S, OH K H, et al. A waterborne outbreak involving hepatitis A virus genotype IA at a residential facility in the Republic of Korea in 2015[J]. J Clin Virol, 2017, 94: 63-66.

[10]MESSENS W, FERNANDEZ-ESCAMEZ P S, LEES D, et al.Thermal processing of live bivalve molluscs for controlling viruses:on the need for a risk-based design[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2017, 19: 1-12.

[11]FOSTER M A, WEIL L M, JIN S, et al. Transmission of hepatitis A virus through combined liver-small intestine-pancreas transplantation[J]. Emerg Infect Dis, 2017, 23(4): 590-596.

[12]PARK H, LEE Y J, SEONG M W, et al. Comparison of 3 automated immunoassays for detection of anti-hepatitis A virus immunoglobulin M in a tertiary care hospital[J]. Ann Lab Med,2013, 33(2): 121-124.

[13]馬紅霞, 楊藺. MODULAR ANALYTICS E170全自動(dòng)免疫分析儀精密度驗(yàn)證情況分析[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(4):476-478.

[14]周文亭, 王鋒, 尹文嬌, 等. 國(guó)產(chǎn)甲型肝炎病毒總抗體檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)疫苗和免疫, 2013, 19(3): 240-245.

[15]黃嫵姣, 薛元霞, 楊佩樺, 等. 電化學(xué)發(fā)光免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM抗體的比較[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院,2016, 16(3): 383-385.

[16]張海軍. 類風(fēng)濕因子對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)HBsAg的影響[J]. 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 45(3): 295-297.

[17]MYLONAKIS E, PALIOU M, LALLY M, et al. Laboratory testing for infection with the human immunodeficiency virus:established and novel approaches[J]. Am J Med, 2000, 109(7):568-576.

[18]吳玉紅. ELSIA法檢測(cè)HBsAg出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因探討[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生, 2010, 48(19): 81-82.