蔡萌萌，戶紅通，劉子強，徐慶陽,2,3，陳寧,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457)3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

L-羥脯氨酸是膠原蛋白的主要組成成分，具有抗氧化、抗輻射、減肥、治療疾病等作用，在醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面具有廣泛應用。L-羥脯氨酸的生產(chǎn)方法有生物提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法。目前，國內(nèi)生產(chǎn)L-羥脯氨酸的主要方法是生物提取法，但該方法存在純化步驟長，成本高，廢棄物污染嚴重等缺點[1]；化學合成法也因成本高昂而不適合工業(yè)生產(chǎn)[2]；微生物發(fā)酵法具有原料來源廣泛，反應所需能耗低，環(huán)境污染小等優(yōu)點。

可靠的活細胞量是發(fā)酵過程中重要的參數(shù)之一，有代謝活力的細胞量與生產(chǎn)效率密切相關[3]。發(fā)酵過程中需要根據(jù)細胞數(shù)量來調(diào)節(jié)補料[4]，傳統(tǒng)的補料策略通常是根據(jù)發(fā)酵液的吸光度來調(diào)節(jié)，但吸光度反映的是發(fā)酵液中的細胞總量，包括死細胞和活細胞，同時它的數(shù)值會在一定程度上受培養(yǎng)基成分的影響，所以單純根據(jù)吸光度并不能對發(fā)酵過程進行準確的調(diào)控?；罴毎诰€檢測儀能夠?qū)崟r監(jiān)測發(fā)酵過程中的電容，只有具有完整細胞膜的細胞才能被極化形成電容，而細胞膜破裂的死細胞和發(fā)酵液中的培養(yǎng)基顆粒等不會形成電容，所以不會被檢測到[5]，且電容值和活細胞數(shù)量之間存在線性關系[6]，根據(jù)該數(shù)值調(diào)控L-羥脯氨酸發(fā)酵，能夠有效地控制發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的形成，提高產(chǎn)品產(chǎn)量和糖酸轉化率。

本實驗在安裝有活細胞在線檢測儀的發(fā)酵罐中進行L-羥脯氨酸的發(fā)酵，發(fā)酵過程中根據(jù)電容值進行補料調(diào)節(jié)，通過對傳統(tǒng)補料發(fā)酵與活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵的代謝流量進行分析，確定活細胞在線監(jiān)控補料技術對L-羥脯氨酸發(fā)酵的影響，為進一步提高L-羥脯氨酸產(chǎn)量，提高糖酸轉化率，減少副產(chǎn)物的形成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

Escherichiacoli4HYP，由天津科技大學代謝工程研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.4 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，卡那霉素50 mg/L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，檸檬酸0.5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO42 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L，卡那霉素50 mg/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種活化

在無菌條件下，取2環(huán)保菌管中的菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h，再將斜面菌種接種于250 mL茄形瓶中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h。

1.3.2 5 L罐種子培養(yǎng)

在無菌條件下，將適量無菌水倒入茄形瓶中，用接種環(huán)將菌體懸浮，然后采用火焰接種的方式將菌懸液接種于5 L種子罐培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為37 ℃，初始通氣量為2 L/min，初始攪拌轉速為200 r/min，通過自動流加25%的氨水控制培養(yǎng)基pH為7.0～7.2，當溶氧低于25%時，通過攪拌和通風控制溶氧在25%～30%，以泡敵消泡，每隔2 h測樣、記錄數(shù)據(jù)，當OD600值達到15左右時，準備接入發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.3 30 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

在小學語文教學中，通過閱讀教學可以培養(yǎng)學生的綜合能力，提高學生的語文素養(yǎng)，因此，教師要加強閱讀教學，使閱讀教學發(fā)揮重要的作用，確保學生閱讀學習的有效性，要提倡新課改的教學理念，創(chuàng)新教學方法，合理地運用多元化教學方式，使小學語文閱讀教學工作得到良好的進展，使其發(fā)揮重要的教學價值，下面對小學語文閱讀教學策略進行詳細的分析和探討。

按10%的接種量將種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，通過自動流加25%的氨水控制培養(yǎng)基pH為7.0～7.2，通過攪拌和通風控制溶氧在25%～30%，當培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡時，以一定的脈沖比流加80%的葡萄糖溶液，當溶氧無法達到25%時，保持最大轉速和通風繼續(xù)發(fā)酵，發(fā)酵過程中，以泡敵消泡，每隔2 h測樣、記錄數(shù)據(jù)。

1.4 分析方法

1.4.1 pH值測定

采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙及發(fā)酵罐附帶的pH電極進行測定。

1.4.2 菌體濃度測定

見參考文獻[7]。

1.4.3L-羥脯氨酸含量測定

取適量發(fā)酵液于13 000 r/min離心2 min，獲得發(fā)酵上清液，取20 μL上清液加入1 mL 5%雙氧水溶液中，滴2滴1% CuSO4溶液，然后加入1 mL 10% NaOH溶液，搖勻后室溫反應10 min，直至淡黃色消失，不再產(chǎn)生氣泡，加入1 mL 1%對二甲氨基苯甲醛硫酸溶液，搖勻后沸水浴5 min，顏色由粉紅色變?yōu)榘导t色，冷卻后加入10 mL蒸餾水，搖勻后在560 nm處測吸光度，根據(jù)標準曲線求得L-羥脯氨酸濃度。其中標準曲線的繪制方法為：分別配制質(zhì)量濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的L-羥脯氨酸標準溶液，按照上述方法進行測定，繪制標準曲線。

1.4.4 有機酸含量測定

采用高效液相色譜法檢測有機酸含量。色譜柱Aminex HPX-87H Column(300 mm×7.8 mm)；流動相5 mmol/L H2SO4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；紫外檢測波長215 nm。

1.4.5 氨基酸副產(chǎn)物測定

采用Elite-AAA氨基酸分析儀進行測定。

1.4.6 活細胞在線檢測

使用來自ABER公司的活細胞在線檢測儀，將其連接在30 L發(fā)酵罐上，121 ℃、20 min原位滅菌，在接入種子液前進行清零處理，接種后進行計數(shù)處理，活細胞在線檢測儀即可將發(fā)酵液中的電容信號經(jīng)過信號處理和軟件分析計算自動得出電容值。

1.4.7L-羥脯氨酸生物合成代謝流平衡模型的建立

見參考文獻[8-11]。

2 結果與分析

2.1 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對補糖速率的影響及最佳補糖策略的確定

常規(guī)補料發(fā)酵L-羥脯氨酸是根據(jù)OD600值調(diào)整補糖速率，活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵是根據(jù)活細胞在線檢測儀顯示的電容值進行補料調(diào)節(jié)，發(fā)酵過程中，OD600值和電容值的變化趨勢如圖1所示。

圖1 OD600值與電容Fig.1 OD600 and capacitance

由圖1可以看出，在菌體生長的遲緩期和對數(shù)期，OD600值和電容值的增長趨勢大致相同，當菌體生長達到穩(wěn)定期之后，OD600依然表現(xiàn)出輕微增長的趨勢，而電容值則先呈穩(wěn)定狀態(tài)，然后出現(xiàn)明顯下降的趨勢。這是因為穩(wěn)定期時，菌體生長和死亡的數(shù)量處于動態(tài)平衡之中，吸光度只能反映出細菌總數(shù)，不能區(qū)分死、活細胞，所以OD600只能表現(xiàn)出菌體數(shù)緩慢增長的狀態(tài)，而活細胞在線檢測儀是檢測發(fā)酵液中活菌體形成的電容體系，細胞膜通透性發(fā)生變化的死菌體不會被檢測到，因此，電容值能及時反映出活菌數(shù)狀態(tài)[12]。穩(wěn)定期之后，菌體生長進入衰亡期，菌體死亡數(shù)量大于生長數(shù)量，此時，電容值呈明顯下降趨勢，OD600值仍呈穩(wěn)定狀態(tài)。

為了比較常規(guī)補料發(fā)酵和活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵的區(qū)別，確定活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵的最佳補糖策略，本實驗對補糖策略1、2、3、4和5進行了比較，其中，策略1是常規(guī)補料發(fā)酵，策略2、3、4和5是活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵，具體補糖速率如圖2所示。不同補糖策略對L-羥脯氨酸產(chǎn)量及乙酸積累量的影響如圖3所示。

圖2 活細胞在線監(jiān)控發(fā)酵對補糖速率的影響Fig.2 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on sugar supplement rate

圖3 不同補糖策略對L-羥脯氨酸產(chǎn)量及乙酸積累量的影響Fig.3 Effect of different sugar supplement strategies on the L-hydroxyproline production and accumulation of acetic acid

由圖2可以看出，在菌體生長穩(wěn)定期之前，常規(guī)補料和活細胞在線監(jiān)控補料兩種補料方式的補糖速率基本相同，但穩(wěn)定期之后，OD600值仍呈緩慢上升趨勢，而電容值能呈現(xiàn)出活菌數(shù)減少的趨勢。因此，采用常規(guī)補料發(fā)酵策略不能及時對補糖速率進行調(diào)整，而活細胞在線監(jiān)控補料能夠在發(fā)酵中后期及時降低補糖速率，從而減少副產(chǎn)物的形成，降低生產(chǎn)成本。由圖3可知，隨著中后期補糖速率的降低，發(fā)酵液中乙酸積累量逐漸減少，同時也降低了對菌體的抑制作用，產(chǎn)量得以提高，但以策略5(發(fā)酵中后期及時降低補糖速率，最終降到8.5 g/(L·h))進行補糖時，可能是由于補糖量不能滿足菌體需要，最終導致產(chǎn)量較低，所以，確定策略4(發(fā)酵中后期及時降低補糖速率，最終降到9 g/(L·h))為最佳的補糖策略，此時，L-羥脯氨酸產(chǎn)量最高，達42.03 g/L，乙酸積累量為2.75 g/L，比常規(guī)發(fā)酵降低了48.69%。

2.2 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響

采用活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響如圖4所示。

圖4 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對L-羥脯氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on L-hydroxyproline production

采用活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵，在發(fā)酵前24 h，L-羥脯氨酸產(chǎn)量和常規(guī)補料發(fā)酵的產(chǎn)量大致相同，這是因為發(fā)酵22 h之前，兩種補料發(fā)酵方式的控制條件相同，補糖速率也基本一致，但22 h之后，監(jiān)控發(fā)酵及時調(diào)整補糖速率，將補糖速率降低，有效地抑制了副產(chǎn)物的形成，而常規(guī)發(fā)酵卻沒有及時對補糖速率進行調(diào)整，導致副產(chǎn)物積累，對菌體產(chǎn)生抑制作用，24 h之后，監(jiān)控發(fā)酵的產(chǎn)量明顯超過常規(guī)發(fā)酵的產(chǎn)量，最終，發(fā)酵32 h，活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵L-羥脯氨酸的產(chǎn)量達到42.03 g/L，較常規(guī)補料發(fā)酵的37.73 g/L提高了11.39%。

2.3 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對糖酸轉化率的影響

在工業(yè)生產(chǎn)過程中，較高的糖酸轉化率可以給企業(yè)帶來更高的經(jīng)濟效益，采用活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對L-羥脯氨酸糖酸轉化率的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，在發(fā)酵22 h之前，常規(guī)補料發(fā)酵與活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵L-羥脯氨酸的糖酸轉化率基本一致，但22 h之后，活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵降低補糖速率，常規(guī)發(fā)酵卻未及時做出調(diào)整，導致副產(chǎn)物積累，對菌體產(chǎn)生抑制作用，所以，監(jiān)控發(fā)酵的糖酸轉化率明顯超過常規(guī)發(fā)酵的糖酸轉化率，最終達19.79%，較常規(guī)補料發(fā)酵提高了14.92%。所以，活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵可以在一定程度上提高葡萄糖轉變?yōu)長-羥脯氨酸的效率，對降低L-羥脯氨酸生產(chǎn)成本，提高工廠效益有重要的意義。

圖5 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對糖酸轉化率的影響Fig.5 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on glucose conversion rate

2.4 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵對L-羥脯氨酸代謝流的影響

基于L-羥脯氨酸代謝網(wǎng)絡，得到化學計量平衡式和代謝節(jié)點處反應速率方程，分別見表1和表2。

根據(jù)發(fā)酵過程中菌體的生長情況，假設22～28 h這一階段細胞處于擬穩(wěn)態(tài)，測定此時間段葡萄糖、丙氨酸、乳酸、乙酸、賴氨酸和L-羥脯氨酸的胞外濃度，分別計算其積累或消耗速率，再利用MATLAB軟件計算L-羥脯氨酸生物合成途徑的代謝流分布情況，得到的結果如圖6和圖7所示。

表1 化學計量平衡式Table 1 Stoichiometric equation

表2 代謝節(jié)點處反應速率方程Table 2 Reaction rate equation of metabolic nodes

圖6 常規(guī)補料發(fā)酵時L-羥脯氨酸合成代謝流分布Fig.6 Metabolic flux distribution of L-hydroxyproline without online monitoring feed fermentation of living cells

圖7 活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵時L-羥脯氨酸合成代謝流分布Fig.7 Metabolic flux distribution of L-hydroxyproline with online monitoring feed fermentation of living cells

6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate, G6P)、丙酮酸(pyruvic acid, Pyr)和異檸檬酸(isocitric acid, ICI)是L-羥脯氨酸生物合成代謝途徑的關鍵節(jié)點。G6P決定著流向糖酵解途徑(glycolytic pathway, EMP)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, HMP)的流量分布，HMP途徑能夠為L-羥脯氨酸合成中心代謝途徑的關鍵反應提供還原力，使更多的代謝流流向L-羥脯氨酸；Pyr是EMP途徑進入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA)的入口，當EMP途徑的代謝流量超過TCA循環(huán)的代謝能力時，會使代謝流流向副產(chǎn)物，造成副產(chǎn)物的積累；ICI的合成需要CO2固定反應和乙醛酸循環(huán)提供草酰乙酸(oxalacetic acid, OAA)，而ICI又是L-羥脯氨酸合成的前體物，同時也是TCA循環(huán)轉向乙醛酸循環(huán)的入口代謝物，所以ICI對調(diào)節(jié)TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)之間的流量分配具有重要作用。由圖7可知，常規(guī)發(fā)酵進入EMP途徑和HMP途徑的代謝流分別為63.40、36.60，生成乙酸的代謝流為5.83，從ICI進入乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)的代謝流分別為4.44、151.58，L-羥脯氨酸合成的代謝流為23.20，而活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵進入EMP途徑的的代謝流為58.01，進入HMP途徑的代謝流為41.99，生成乙酸的代謝流為5.54，從ICI進入乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)的代謝流分別為3.69、147.43，L-羥脯氨酸合成的代謝流為26.96。所以，采用活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵，EMP途徑和乙醛酸循環(huán)的代謝流分別減少了8.50%、16.89%，HMP途徑的代謝流增加了14.73%，乙酸合成的代謝流減少了4.97%，L-羥脯氨酸合成的代謝流提高了16.21%。

3 結論

本研究利用活細胞在線監(jiān)控技術調(diào)節(jié)L-羥脯氨酸補料發(fā)酵，能夠在發(fā)酵中后期根據(jù)活細胞量及時調(diào)整補糖策略，確定了活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵的最佳補糖策略，避免了因補糖過多導致的副產(chǎn)物大量積累，或補糖過少導致的L-羥脯氨酸產(chǎn)量下降等問題，提高了葡萄糖利用率，降低了生產(chǎn)成本。采用活細胞在線監(jiān)控補料發(fā)酵，在發(fā)酵中后期及時降低補糖速率，最終降到9 g/(L·h)時最佳，最終，L-羥脯氨酸產(chǎn)量提高了11.39%，乙酸積累量減少了48.69%，糖酸轉化率提高了14.92%，EMP途徑和乙醛酸循環(huán)的代謝流分別減少了8.50%、16.89%，HMP途徑的代謝流增加了14.73%，乙酸合成的代謝流減少了4.97%，L-羥脯氨酸合成的代謝流提高了16.21%。

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