王琪月 孟淑君 張 柯 張戰(zhàn)輝 湯繼華 丁 冬,*

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玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA的研究

王琪月1孟淑君1張 柯2張戰(zhàn)輝1湯繼華1丁 冬1,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南鄭州 450002;2河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 河南鄭州 450002

雜種優(yōu)勢已廣泛應(yīng)用于玉米育種, 在提高玉米產(chǎn)量、品質(zhì)以及增強(qiáng)抗逆性等方面起到了重要的作用, 然而雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制尚不清楚。植物miRNA主要在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。為闡明miRNA是否及如何對(duì)玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢產(chǎn)生影響, 本研究對(duì)玉米雜交種鄭單958及其親本自交系(昌7-2和鄭58)進(jìn)行了高通量miRNA測序和降解組測序。取玉米雌穗花序分生組織(IM)發(fā)育為成對(duì)小穗分生組織(SPM), 進(jìn)而產(chǎn)生小穗分生組織(SM), 及小花分生組織(FM)將3個(gè)不同時(shí)期的雌穗樣品用于miRNA建庫測序, 鑒定出16個(gè)miRNA家族中的81個(gè)保守miRNA為非加性表達(dá), 認(rèn)為是與雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢形成相關(guān)的miRNA; 3個(gè)階段中分別檢測到80.30%、56.06%和48.10%的非加性表達(dá)的miRNA被顯性或超顯性抑制。鑒定出8種新的miRNA, 屬于7個(gè)miRNA家族。通過雌穗降解組測序, 發(fā)現(xiàn)在鄭單958及其親本自交系中共同檢測到的miRNA靶向42個(gè)基因的82個(gè)轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建了miRNA參與玉米雌穗雜種優(yōu)勢的模型, 并推測在雌穗發(fā)育早期階段雜交種雌穗的miRNA的普遍抑制導(dǎo)致其靶基因上調(diào)表達(dá), 隨著發(fā)育進(jìn)程miRNA逐步解除抑制, 帶來其靶基因表達(dá)量的逐步減少, 這種miRNA與其靶基因的拮抗關(guān)系也許與玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢形成有關(guān)。

雌穗發(fā)育; 雜種優(yōu)勢; miRNA; 降解組測序; 玉米

雜種優(yōu)勢即F1雜交種產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆等性狀均優(yōu)于其純合親本系的生物學(xué)現(xiàn)象[1]。目前, 雜種優(yōu)勢雖然已經(jīng)成功運(yùn)用于作物育種并提高了作物產(chǎn)量, 但其分子機(jī)制尚未完全解析。根據(jù)等位基因互作的原理, 前人提出顯性、擬顯性和超顯性假說[2]3種主要理論來解釋雜種優(yōu)勢遺傳基礎(chǔ)。近年來, 隨著高通量技術(shù)的發(fā)展, 非等位基因間互作同樣被認(rèn)為是產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的原因, 并據(jù)此提出了上位性[3]和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)假說[4]。

玉米作為世界上重要的禾谷類作物, 不僅為人類和動(dòng)物提供食材, 還可以作為工業(yè)原料用于生產(chǎn)乙醇。由于玉米在表型、等位基因[5]、轉(zhuǎn)錄[6]和翻譯[7]水平上豐富的變異, 以及有已測序的參考基因組信息, 可作為探索雜種優(yōu)勢遺傳機(jī)制的理想模式作物[5]。

miRNA是長度為18~25 nt的非編碼內(nèi)源小分子RNA, 在轉(zhuǎn)錄后水平起到關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控作用[8]。植物miRNA與其靶向mRNA完全或近乎完全地互補(bǔ)配對(duì), 會(huì)引起靶向mRNA斷裂, 導(dǎo)致基因沉默[9]。miRNA調(diào)控參與多種生物學(xué)進(jìn)程, 如器官分化[10]、葉生長[11]、性別決定[12]、逆境脅迫[13]和雌雄不育[14]。在H99×B73雜交種與其親本自交系授粉10 d后的籽粒樣品中, 發(fā)現(xiàn)miR167被過度誘導(dǎo), 表明miRNA可能參與玉米雜種優(yōu)勢相關(guān)基因的調(diào)控[15]。Ding等[16]基于高通量測序數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)保守的玉米miRNA在玉米雜交種胚中較其親本自交系豐度低, 提出在雜交種中miRNA的普遍抑制可能是產(chǎn)生玉米胚萌發(fā)雜種優(yōu)勢的原因之一。

高通量測序技術(shù)(high throughput sequencing)可對(duì)DNA或RNA分子精確測序, 從而能夠?qū)δ骋晃锓N的基因組進(jìn)行全貌分析。高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)以及功能基因組學(xué)研究的許多方面[17]。降解組測序是一種新的鑒定miRNA靶基因的實(shí)驗(yàn)方法。它綜合了高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)分析兩者的優(yōu)勢, 對(duì)植物體中由miRNA介導(dǎo)而產(chǎn)生的mRNA降解片段深度測序分析, 從而高效、準(zhǔn)確地篩選出與之相對(duì)應(yīng)的靶基因。降解組測序已成功應(yīng)用于鑒定細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)[18], 棉花體細(xì)胞胚發(fā)生[19]和玉米胚性愈傷組織[20]miRNA的靶基因等研究中。Zhang等[21]報(bào)道基于自交系B73的miRNA文庫深度測序, 認(rèn)為miRNA測序和降解組測序結(jié)合的方法是識(shí)別miRNA靶標(biāo)的可靠方法。

玉米雌穗分化可分為4個(gè)階段。從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長時(shí), 位于植株頂端的頂端分生組織(SAM)轉(zhuǎn)化成花序分生組織(IM); 隨著IM的膨大和伸長, 形成多行排列整齊的分生組織, 即成對(duì)小穗分生組織(SPM); 每一個(gè)SPM進(jìn)而分化出兩個(gè)短分枝的小穗分生組織(SM); 每個(gè)SM分化出兩個(gè)小花分生組織(FM)[22]。玉米雌穗產(chǎn)量相關(guān)性狀, 包括穗行數(shù)、穗長和粒重都具有雜種優(yōu)勢, 第3階段決定穗粒行數(shù)和穗長。玉米花序形態(tài)與籽粒產(chǎn)量之間有明顯聯(lián)系。研究推測關(guān)鍵調(diào)控基因在表達(dá)時(shí)間、表達(dá)位置、表達(dá)水平的變化可以解釋玉米和其他禾本科作物的結(jié)構(gòu)和遺傳差異[23]。Chuck等[12]研究表明編碼玉米miRNA156的通過靶向AP2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子來決定玉米性別分化和分生組織細(xì)胞分裂能力。玉米雌穗發(fā)育中的SPM至SM階段對(duì)miRNA的深度測序表明, miRNA普遍參與玉米雌穗的發(fā)育[24], 然而miRNA影響雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢的機(jī)制仍不清楚。

本研究對(duì)中國大面積種植的玉米雜交種鄭單958及其親本自交系昌7-2和鄭58進(jìn)行高通量深度測序, 以期獲得與雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢相關(guān)的miRNA。結(jié)果表明, miRNA參與雌穗發(fā)育, 尤其是雌穗細(xì)胞分化早期階段發(fā)育的雜種優(yōu)勢形成。通過降解組測序鑒定了miRNA的靶基因, 并結(jié)合miRNA和降解組測序構(gòu)建了玉米雌穗發(fā)育中雜種優(yōu)勢可能的miRNA調(diào)控途徑。

1 材料與方法

1.1 植物材料和RNA提取

玉米雜交種鄭單958及其親本自交系材料(昌7-2和鄭58)各40株種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)基地(河南鄭州, 34°48' N, 113°42' E)。年平均氣溫14.3℃, 年降水量640.9 mm。待葉齡指數(shù)達(dá)到50%以上(6~8片展開葉), 剝開第一穗位雌穗于顯微鏡下觀察其外部形態(tài)。IM至SPM時(shí)期的顯著特點(diǎn)是可以看到生長錐長度大于寬度且在其基部出現(xiàn)了突起; SPM至SM時(shí)期顯著特點(diǎn)是雌穗中部開始出現(xiàn)小穗裂片, 由小穗裂片分化成兩個(gè)成對(duì)的小穗, 呈兩列突起狀; FM時(shí)期顯著特點(diǎn)是小穗突起上會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)突起的小花。分別取IM至SPM時(shí)期和SPM至SM時(shí)期, 以及FM形成時(shí)期3個(gè)階段的雌穗樣品以液氮速凍備用。采用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取雌穗材料總RNA, 用于miRNA文庫構(gòu)建, 并分別取20 μg總RNA用于高通量測序(BGI, 北京)。

1.2 小RNA文庫的構(gòu)建和數(shù)據(jù)分析

使用TRIzol試劑盒(Invitrogen, USA)提取雌穗總RNA, 使用15%PAGE膠分離不同片段大小的RNA, 取16~32 nt之間的條帶, 回收小RNA; 對(duì)這些小RNA加上3'和5'接頭; 反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 經(jīng)過幾輪PCR擴(kuò)增; 用PAGE膠對(duì)RT-PCR產(chǎn)物切膠回收, 溶于EB 溶液, 完成文庫構(gòu)建, 質(zhì)檢后用于高通量測序。對(duì)llumina測序所得的原始數(shù)據(jù), 去除接頭及低質(zhì)量的測序片段獲得高質(zhì)量的測序片段之后, 除去長度小于16 nt的片段, 再比對(duì)基因組, 去除tRNA、rRNA等小分子量RNA。將初級(jí)分析得到的測序片段分類注釋, 可以獲得樣品中包含的各組分及表達(dá)量信息, 排除所有注釋后剩下的小RNA, 于miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.miRBase.org/, Version 21;包括172個(gè)成熟的miRNA)中比對(duì), 當(dāng)測序片段與數(shù)據(jù)庫中已知的miRNA序列錯(cuò)配小于2時(shí), 認(rèn)為該測序片段為保守的miRNA。另一方面, 利用軟件Mireap (http://sourceforge.net/projects/mireap/)預(yù)測新的miRNA。判定一個(gè)小RNA是否為候選miRNA時(shí)要符合以下5個(gè)條件: (1)前體可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu); (2) miRNA序列完全包含于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一個(gè)臂; (3)發(fā)夾的另一臂上預(yù)測的成熟miRNA序列與其互補(bǔ)miRNA*序列之間不超過6個(gè)錯(cuò)配; (4) miRNA或miRNA*序列中不存在環(huán)或中斷; (5)莖環(huán)前體最小自由能指數(shù)MFEI>0.85[25]。

1.3 雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢的miRNA表達(dá)模式

為了判斷樣品之間miRNA的表達(dá)量差異, 將每個(gè)樣品里的所有miRNA都進(jìn)行歸一化處理, 處理后如果某一miRNA在4個(gè)時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量都小于1RPM 則不予考慮[16], 將玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA歸類為6組[16]: (1) + +: 超高親表達(dá), 雜交種的表達(dá)量顯著高于兩個(gè)親本自交系且雜交種的表達(dá)量和其親本中高表達(dá)量親本的差異超過10%; (2) +: 高親表達(dá), 雜交種的表達(dá)量高于其親本, 雜交種的表達(dá)量和其親本中高表達(dá)量親本的差異低于10%; (3) +-: 加性表達(dá), 雜交種的表達(dá)量介于2個(gè)親本表達(dá)量之間, 且雜交種的表達(dá)量和其親本的表達(dá)量中值的差異低于10%; (4)-: 低親表達(dá), 雜交種的表達(dá)量低于其親本, 雜交種的表達(dá)量和其親本中低表達(dá)量親本的差異低于10%; (5)--: 超低的親本表達(dá), 雜交種的表達(dá)量顯著低于其親本, 雜交種的表達(dá)量和其親本中低表達(dá)量親本的差異超過10%; (6)顯示出和前幾種不同的表達(dá)模式(用“D”表示)與中親值差異大于10%。

1.4 降解組文庫的構(gòu)建和數(shù)據(jù)分析

從每種材料取約20 μg總RNA混合樣品用來制備降解組文庫, RIN>7.0時(shí), 采用Bioanalyzer 2100和RNA6000 Nano Lab Chip Kit (Agilent, CA, USA)分析總RNA質(zhì)量和純度。參考并改進(jìn)前人報(bào)道的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行建庫測序[26]: (1)使用約150 ng RNA加5￠接頭, 然后將帶接頭的oligo(dT)將單鏈反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 并采用生物素化標(biāo)記的隨機(jī)引物退火; (2)通過生物素化隨機(jī)引物捕獲Strapavidin RNA片段; (3) 5￠-端與僅含有5￠單磷酸酯的RNA結(jié)合; (4)逆轉(zhuǎn)錄和PCR; (5)僅對(duì)代表原始RNA的5￠端插入片段的前36個(gè)核苷酸測序。然后按照LC-BIO (中國杭州)提供的方案, 在IlluminaHiseq 2500上進(jìn)行單端測序(36 bp)。通過Fisher精確檢驗(yàn)、卡方2×2檢驗(yàn)、卡方×檢驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和ANOVA方差分析測定降解組數(shù)據(jù)水平差異, 設(shè)定每個(gè)檢驗(yàn)的顯著性閾值為0.01和0.05。

1.5 miRNA莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄質(zhì)量檢測

對(duì)雜交種鄭單958及其親本自交系昌7-2和鄭58的發(fā)育中雌穗的miRNA的表達(dá)量進(jìn)行分析, 以驗(yàn)證miRNA測序結(jié)果。選用8個(gè)保守miRNA引物對(duì)提取到的RNA采用莖環(huán)法[27]進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 對(duì)靶基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 用于RT-qPCR反應(yīng), 內(nèi)參為玉米基因, 采用2–ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量, RT-qPCR引物列于表1中, 設(shè)有3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米miRNA的深度測序

通過對(duì)雜交種鄭單958及其親本自交系雌穗的小分子量RNA文庫進(jìn)行高通量測序, 來鑒定影響雌穗雜種優(yōu)勢的miRNA。對(duì)9個(gè)樣本測序, 得到175 214 241個(gè)原始讀數(shù)。每個(gè)樣本平均為19 468 249個(gè)讀數(shù), 范圍為17 410 285到22 869 631。平均每個(gè)樣品為18 672 474個(gè)讀數(shù), 范圍為16 909 865至22 244 845。測序所得的小 RNA幾乎涵蓋所有 RNA, 包括tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、外顯子和內(nèi)含子降解片段等, 通過去除接頭及低質(zhì)量的測序片段獲得高質(zhì)量的測序片段, 共有138 600 762個(gè)候選miRNA讀數(shù), 每個(gè)樣本平均為15 400 084個(gè), 范圍為11 902 891至19 538 721。在9個(gè)樣本中, 將候選miRNA與玉米B73基因組(RefGen_v3)比對(duì), 21 nt的RNA最豐富, 占總量61.60%, 19 nt的RNA次之, 占總量15.51%, 這些miRNA代表玉米雌穗成熟miRNA的典型長度(圖1)。

2.2 玉米雌穗發(fā)育時(shí)期與雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA的分類

在雜交種和其親本中檢測到3個(gè)發(fā)育階段分別有100、95和94個(gè)保守miRNA, 大多數(shù)miRNA在雜交種和其親本自交系的雌穗發(fā)育過程中是非加性表達(dá)的。在IM至SPM階段, SPM至SM階段和FM階段分別有83、80和87個(gè)差異表達(dá)的miRNA, 3個(gè)發(fā)育階段均檢測到的81個(gè)miRNA。將入選的81個(gè)玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA分為5種類型: 3個(gè)雌穗發(fā)育階段中分別有3、18和38個(gè)miRNA為超高親表達(dá)(+ +); 10、11和2個(gè)miRNA為顯性高親表達(dá)(+); 15、15和3個(gè)miRNA為加性表達(dá)(+-); 0、9和2個(gè)miRNA在親本系中為顯性低親表達(dá)(-); 53、28和36個(gè)miRNA為超低親表達(dá)(--), 如表2所示。

表1 玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA和其靶基因的檢測引物序列

#代表降解組測序未檢測到玉米miR168a/b的靶基因, 因此此靶基因?yàn)轭A(yù)測獲得。

#represent the target genes of zma-miR168a/b were not found in the degradome sequencing data, so they were predicted.

圖1 miRNA的長度分布

表2 共檢測到的保守miRNA的表達(dá)趨勢

(續(xù)表2)

IM: 雌穗花序分生組織; SPM: 成對(duì)小穗分生組織; SM: 小穗分生組織; FM: 小花分生組織。

IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem.

2.3 通過降解組測序鑒定靶基因

通過降解組測序來鑒定玉米雌穗樣品的miRNA的靶基因。由于miRNA產(chǎn)生和目標(biāo)mRNA降解之間可能存在延遲, 因此對(duì)所有3種材料的3個(gè)階段的混合樣品進(jìn)行測序, 共檢測出42個(gè)基因的82個(gè)轉(zhuǎn)錄本。miRNA-mRNA切割位點(diǎn)如表3所示, 對(duì)這些目標(biāo)基因進(jìn)一步進(jìn)行GO功能注釋分析, 表明雌穗中miRNA的目標(biāo)基因側(cè)重于編碼轉(zhuǎn)錄因子(31/42)(表3)。

表3 降解組測序檢測到的玉米雌穗雜種優(yōu)勢相關(guān)miRNA的靶基因

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.4 新miRNA預(yù)測和其靶基因

在自交系昌7-2、鄭58和雜交種鄭單958雌穗發(fā)育的3個(gè)階段分別發(fā)現(xiàn)了216、174和203個(gè)miRNA與保守的miRNA不匹配, 但可形成如pre-miRNA莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的側(cè)翼序列, 它們可作為候選的miRNA。在9個(gè)樣品中共檢測到27個(gè)候選的miRNA, 通過計(jì)算這27個(gè)miRNA的MFEI進(jìn)一步提高預(yù)測精度, 其中有8個(gè)MFEI大于0.85, 這8個(gè)miRNA最有可能是新的玉米 miRNA。根據(jù)成熟miRNA序列, 將8種預(yù)測的新的miRNA分類為7個(gè)家族, 其序列、染色體位置和MFEIs如表4所示, 前體miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)見圖2 (由MatLAB bio-tool創(chuàng)建)。這些新預(yù)測的miRNA都由莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體剪切加工而來, 前體序列長度介于98~328 bp之間, 莖環(huán)前體最小自由能指數(shù)MFEI> 0.85, 成熟序列的長度為21 bp, 且對(duì)靶基因的抑制方式為直接剪切。有趣的是, 發(fā)現(xiàn)miR-7a和miR-7b具有相同的成熟miRNA序列, 并呈簇狀分布在玉米第1染色體, 該特征與一些保守的成簇分布miRNA前體特征一致[28]。通過在線軟件psRNA Target預(yù)測這8個(gè)新發(fā)現(xiàn)的玉米miRNA的靶基因, 共預(yù)測到49個(gè)miRNA的靶基因(表5), 基因預(yù)測時(shí)候參數(shù)全部使用默認(rèn)值, 搜索的靶位點(diǎn)文庫為玉米的全部Unigene序列。對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能注釋分析(圖3), 除了功能未知的基因外, 多為編碼信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(6/49)的基因, 其次是編碼應(yīng)激反應(yīng)蛋白的基因(4/49)。

表4 新的miRNA及其特性

IM: 雌穗花序分生組織; SPM: 成對(duì)小穗分生組織; SM: 小穗分生組織; FM: 小花分生組織; MFEI: 自由能指數(shù)。

IM: inflorescence meristem; SPM: spikelet pair meristem; SM: spikelet meristem; FM: flower meristem; MFEI: minimal free energy index.

圖2 新的玉米miRNA的前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)

miR-n7a和miR-n7b享有共同的pre-miRNA和成熟miRNA序列, 它們的特征被各自的pre-miRNA的基因組位置所區(qū)分, 藍(lán)色代表已配對(duì), 紅色表示未配對(duì), 綠色代表成熟的新的miRNA。

miR-n7a and miR-n7b share the same pre-miRNA and mature miRNA sequences, the character that distinct them from each other is the genome location of each pre-miRNAs. The blue residues are paired, red ones are unpaired, and green strings show the mature novel miRNAs.

2.5 RT-PCR檢測保守miRNA和其靶基因的表達(dá)量

采用莖環(huán)法實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測miR159、miR160、miR167、miR168、miR169、miR172a、miR172e和miR390這8個(gè)miRNA的表達(dá)趨勢(圖4)。使用方差分析來分析miRNA和其對(duì)應(yīng)靶基因的RT-PCR的數(shù)據(jù)表明, 所選miRNA的相對(duì)表達(dá)量與深度測序數(shù)據(jù)相一致。根據(jù)miRNA的表達(dá)趨勢(表2), miR390在雌穗發(fā)育過程中, 表達(dá)量是逐漸增加的, miR172a、miR172e在SPM至SM期大量表達(dá), 這與我們的定量結(jié)果(圖4)是一致的。

圖3 新miRNA靶基因功能分類

圖中數(shù)字表示基因個(gè)數(shù)。

The numbers show the number (s) of target genes.

3 討論

自交系與其相應(yīng)的F1雜交之間的表型差異與基因本身的功能、基因表達(dá)的時(shí)間、數(shù)量有關(guān)[29-30]。水稻、小麥和玉米在雜交種中比其親本中檢測到的表達(dá)下調(diào)的miRNA要多于表達(dá)上調(diào)的miRNA, 表明非加性表達(dá)的miRNA, 尤其是下調(diào)的miRNA可能與作物的雜種優(yōu)勢形成有關(guān)[31-32,16]。本研究發(fā)現(xiàn), 雜交種鄭單958在早期的IM至SPM的發(fā)育階段中有很多miRNA被下調(diào), 說明miRNA的負(fù)調(diào)控可能在玉米雌穗發(fā)育雜種優(yōu)勢中起著重要作用。此外, miRNA家族的非加性表達(dá)模式與玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢形成有關(guān), 且在雌穗發(fā)育的過程中這種表達(dá)模式是變化的。在此研究基礎(chǔ)上構(gòu)建了miRNA對(duì)玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖5。

圖5 miRNA對(duì)玉米雌穗發(fā)育的雜種優(yōu)勢的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

miRNA通過剪切靶mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。大多數(shù)miRNA的靶基因是轉(zhuǎn)錄因子(TFs), 如(miR156)[33]、(miR167)[34]、(miR164)[35]和(miR396)[36], 其作用是調(diào)節(jié)植物發(fā)育。玉米雌穗發(fā)育中miRNA的非加性表達(dá)模式是變化的, 雜交種雌穗早期發(fā)育階段的miRNA靶基因較高水平的表達(dá)導(dǎo)致下游基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平提高; 后期發(fā)育階段中miRNA表達(dá)量的逐漸上升, 導(dǎo)致其靶基因抑制加強(qiáng), 這可能是玉米雌穗發(fā)育性狀雜種優(yōu)勢的形成原因之一。

前期研究顯示,是miRNA-RISC的負(fù)反饋調(diào)節(jié)子, 是擬南芥ARGONAUTE家族的唯一成員, 參與miRNA定向的mRNA切割過程。AGO1體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和AGO1對(duì)miR168的轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定需要miR168和基因的共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。miR168和其靶基因共調(diào)控miRNA的負(fù)反饋調(diào)控途徑[37], 因?yàn)槭莔iRNA通路的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 在雌穗發(fā)育早期的的mRNA表達(dá)變異可能導(dǎo)致miRNA活動(dòng)改變。玉米miR168的表達(dá)可能抑制, 并以此影響多個(gè)其他miRNA的靶基因, 因此雜交種與親代自交系相比, 其功能性基因種類更有可能多樣化, 并且表達(dá)更加豐富。

玉米卷葉基因是擬南芥基因的同系物。ath-miR166介導(dǎo)的HD-Zip調(diào)節(jié)側(cè)生器官背腹軸極性的建立和維持[38], 除了參與調(diào)節(jié)葉片極性[39],干旱和植物激素[40-41]等各種脅迫條件也能誘導(dǎo)HD-Zip家族的產(chǎn)生。測序表明高豐度的miRNA166成員在雌穗發(fā)育過程中被逐漸誘導(dǎo), 在IM至SPM期降低, SPM至SM期逐步提高, 并在FM階段被顯著誘導(dǎo)。結(jié)合miR166成員的高拷貝數(shù)和其逐漸誘導(dǎo)模式, 表明HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子(或許是)可能在雜合玉米雌穗發(fā)育中被逐漸抑制, 導(dǎo)致對(duì)植物激素的敏感性降低。

研究顯示miRNA159通過編碼和來調(diào)控種子休眠和發(fā)芽,和是水稻[42]和擬南芥中ABA響應(yīng)的正向調(diào)控因子。ABA是植物成熟和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, 已被證明與許多植物的生物和非生物脅迫反應(yīng)有關(guān)[43]。ABA可以誘導(dǎo)miR159的表達(dá), 降低和的量, 進(jìn)而降低ABA的敏感性[44], 因此可通過誘導(dǎo)miR159建立ABA體內(nèi)平衡。本研究中miR159在雜合體中被逐漸誘導(dǎo), IM至SPM期被顯著抑制, SPM至SM期被抑制, FM期被顯著誘導(dǎo)。雜交種鄭單958雌穗發(fā)育中的miR159的表達(dá)水平逐漸提高, 可能通過影響其靶mRNA而降低ABA敏感性, 表明在玉米雌穗期可能發(fā)生ABA調(diào)控過程。

玉米不定小穗基因I ()是玉米miR172e的靶基因, 在SPM至SM期大量表達(dá)[11-12]。本研究中的miR172e表達(dá)與其他miR172家族成員有所不同, 特別是SPM至SM期間存在較低的拷貝數(shù), 表明miRNA穩(wěn)態(tài)是決定玉米雌穗發(fā)育的主要因素, 而且同一個(gè)基因家族的不同成員也可能發(fā)揮不同的功能。

除miR172外, miRNA家族的其他成員同樣具有顯著的差異表達(dá)水平(表6)。如miR164e與miR164家族的其他成員相比, 其表達(dá)量差異超過100倍, miR156k表達(dá)量差異超過60倍。同一家族差異表達(dá)的miRNA成員不僅具有不同前體, 而且成熟miRNA也很少具有差異序列, 例如zma-miR164e和zma-miR164a-d僅在最后2個(gè)(AG/CA)核苷酸處存在差異。通過比較相同miRNA家族不同成員的豐度, 發(fā)現(xiàn)有關(guān)特定miRNA在不同發(fā)育階段中發(fā)揮的作用, 以此區(qū)分家族中各個(gè)成員的調(diào)節(jié)模式。

4 結(jié)論

構(gòu)建了miRNA通過其靶基因參與雌穗雜種優(yōu)勢形成的可能模式, 并推測miRNA可能在玉米雌穗發(fā)育階段通過非加性表達(dá)參與雌穗雜種優(yōu)勢性狀的建立, 雌穗發(fā)育早期階段miRNA的普遍抑制及隨后時(shí)期的逐漸解除抑制可能是雌穗雜種優(yōu)勢形成的原因。

表6 測序獲得的表達(dá)量數(shù)據(jù)

(續(xù)表6)

(續(xù)表6)

(續(xù)表6)

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Investigation of Maize miRNA Involved in Developing-ear Heterosis

WANG Qi-Yue1, MENG Shu-Jun1, ZHANG Ke2, ZHANG Zhan-Hui1, TANG Ji-Hua1, and DING Dong1,*

1College of Agronomy, Henan Agricultural University / Key Laboratory of Wheat and Maize Crops Science, Zhengzhou 450002, Henan, China;2Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Heterosis has been utilized widely in maize breeding; it plays an important role in increasing yield, improving quality and enhancing stresses resistance. However, the molecular mechanism of heterosis is far from clear. MicroRNAs (miRNAs) act as key regulating factors of gene expression in post-transcriptional level. To investigate whether miRNA-dependent gene regulation is responsible for heterosis during maize ear development, we performed an illumine miRNA deep-sequencing on the most widely-planted elite hybrid Zhengdan 958 and its parental inbred lines (Chang 7-2 and Zheng 58) in China. The ear samples at the developmental stages of inflorescence meristem (IM) producing spikelet pair meristems (SPM), resulting in spikelet meristems (SMs), and floral meristems (FM) were collected for RNA library construction. As a result, 81 conserved miRNAs belonging to 16 miRNA families were identified which were non-additively expressed. At the three stages, 80.30%, 56.06%, and 48.10% of these non-additively expressed miRNAs were repressed ever dominantly or over-dominantly. A total of 82 target transcripts from 42 genes of conserved miRNAs among Zhengdan 958 and its parents were detected via whole genome degradome sequencing. Additionally, eight novel maize miRNAs belonging to seven miRNA families were identified using stringent criteria. Global repression of miRNAs in hybrid ears at the early stage might lead to the up-regulated expressing of their target genes. Moreover, the in-step de-repression of given miRNA family members may be the reason of enhanced repression of their target genes. These results revealed, at least in part, the involvement of maize miRNAs in hybrids leads to higher ear developing vigor compared with its parental lines.

ear development; heterosis; miRNA; degradome;L.

2017-09-29;

2018-03-26;

2018-04-18.

10.3724/SP.J.1006.2018.00796

丁冬, E-mail: dingdong0216@163.com

E-mail: 13633857567@163.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370033)和國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA10A305)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370033) and the National High Technology Research and Development Program of China (2012AA10A305).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180416.0843.006.html