張旗，陳素娟，聶靜，李強(qiáng)*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

清瘟敗毒飲出自清代著名醫(yī)家余師愚之《疫疹一得》，由生石膏、知母、甘草、黃連、黃芩、梔子、犀角(以水牛角代替)、生地黃、赤芍、牡丹皮、連翹、玄參、竹葉、桔梗共14味藥組成，合白虎湯、黃連解毒湯和犀角地黃湯之意[1]。全方具有清熱解毒、涼血瀉火的功效，主治熱毒充斥、氣血兩燔證，與ALI早、中期階段的中醫(yī)病機(jī)頗為吻合，故早期運(yùn)用清瘟敗毒飲能起到良好的治療效果。在非典以及甲型 H1N1 流感合并呼吸窘迫綜合征治療中，臨床證實(shí)清瘟敗毒飲加減為有效藥物，可與西藥合用，作用顯著[2-4]。張長志等組研究清瘟敗毒飲對(duì)ALI大鼠炎癥因子表達(dá)以及肺組織核因子-κB表達(dá)的影響。結(jié)果清瘟敗毒飲可通過有效調(diào)節(jié)LPS致ALI大鼠血中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、 IL-10和抗炎癥細(xì)胞因子IL-13表達(dá)水平，促使炎癥和抗炎癥細(xì)胞因子趨于動(dòng)態(tài)平衡，從而減輕肺部炎癥細(xì)胞浸潤，起到修復(fù)和保護(hù)損傷肺組織的作用[5]，但清瘟敗毒飲對(duì)水腫抑制情況以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。

本課題已對(duì)清瘟敗毒飲高、中、低劑量進(jìn)行劑量考察，結(jié)果高、中劑量均能有效降低大鼠ALI損傷情況，且呈劑量依賴性[6]。然而，清瘟敗毒飲干預(yù)ALI的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確。由于清瘟敗毒飲合白虎湯、黃連解毒湯、犀角地黃湯之意，由14味藥組成，成分復(fù)雜，因此根據(jù)其功效對(duì)其進(jìn)一步拆方分析，拆分為4個(gè)拆方組，分別為：清熱瀉火組(C1)、清熱涼血組(C2)、清熱燥濕組(C3)和其他組(C4)，為闡明其藥效成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量200～220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：NO.11400700130416。

1.2 試劑及主要儀器

大腸桿菌內(nèi)毒素LPS(L2880，Sigma)；TNF-α試劑盒(Abcam)；牛血清白蛋白(A7030，pH-7，Sigma)；考馬斯亮藍(lán)G-250(code:0615，北京拜爾迪生物科技有限公司)；吉姆薩染液(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司)；德國Effendorf 5810R離心機(jī)；BX40F4型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，日本)；AxioCam ERC5s成像系統(tǒng)(德國蔡司)；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；BS110S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

2 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI作用

2.1 清瘟敗毒飲拆方組的制備

清熱瀉火組(C1)：生石膏30 g，知母15 g，生梔子12 g，竹葉15 g。

清熱涼血組(C2)：水牛角12 g，生地黃12 g，赤芍15 g，玄參15 g，牡丹皮12 g。

清熱燥濕組(C3)：黃芩15 g，黃連4.5 g。

其他組(C4)：桔梗12 g，連翹15 g，甘草6 g。

10倍量水回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液合并，減壓濃縮即得拆方組的水提物，濃度分別為0.72 g/ml、0.68 g/ml、0.2 g/ml和0.33 g/ml。

2.2 ALI模型制備

將大鼠隨機(jī)均分為7組，每組10只：空白組(Con)、模型組(LPS)、陽性組(地塞米松，DEX組)、清熱瀉火組(C1)、清熱涼血組(C2)、清熱燥濕組(C3)和其他組(C4)的大鼠頸部正中切口，暴露氣管，除Con組外其余各組用1 mL 注射器經(jīng)氣管滴注LPS(5 mg/kg)溶液(生理鹽水配制,10 mg/mL)，注入后迅速將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液能夠均勻分布在肺中，待大鼠呼吸狀態(tài)平穩(wěn)后，再縫合傷口；Con組在同樣的條件下，向氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水。

2.3 給藥方法

在造模前3天灌胃各拆方組的水提物，每日1次，陽性組 (DEX)于造模前1 h 給予地塞米松注射液(5 mg/kg)，Con組和LPS組灌胃給予治療組等量的生理鹽水，每日1次。7組動(dòng)物均在造模12 h后取材。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 BALF中白細(xì)胞總數(shù)和多形核白細(xì)胞(PMNs)數(shù)

各組大鼠腹主動(dòng)脈取血處死后，剪開頸、胸部皮膚，暴漏氣管并進(jìn)行氣管插管。右肺結(jié)扎，左肺進(jìn)行灌洗，用4℃ PBS 6 mL分3次進(jìn)行灌洗(灌洗時(shí)保證每次打入2 ml、吸出1.5 ml的液體)，收集肺泡灌洗液(BALF)置冰上，離心(4℃，1 300 r/min，10 min)后收集上清液，-80℃保存。離心后的沉淀細(xì)胞重懸于PBS,白細(xì)胞總數(shù)以及PMNs采用血液分析儀進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.4.2 BALF中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和蛋白濃度的測定

取“2.4.1”項(xiàng)中離心后的肺泡灌洗上清液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法對(duì)各組大鼠BALF的上清液進(jìn)行蛋白含量測定。用酶聯(lián)免疫法測定TNF-α的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2.4.3 肺的濕/干比值(W/D)測定

大鼠麻醉后，取肺的右中葉進(jìn)行稱重(濕重)，將其置烘箱中, 60℃烘至恒重，記下干重，計(jì)算得出肺的濕/干比值(W/D)。

2.4.4 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠以腹主動(dòng)脈取血處死后，取肺右下葉，10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺形態(tài)學(xué)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)LPS誘導(dǎo)ALI大鼠BALF中PMNs浸潤情況比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白組的肺泡灌洗液中有極少的PMNs浸潤；LPS組PMNs及白細(xì)胞總數(shù)均較Con組顯著增加(P<0.01)；而C1、C2與C3組的PMNs及白細(xì)胞總數(shù)較LPS組顯著降低(P<0.05)，且以C3組最佳(P<0.01)。白細(xì)胞總數(shù)和PMNs結(jié)果見表1，圖1～2。

表1 清瘟敗毒飲不同拆方組干預(yù)大鼠急性肺損傷的情況比較

注：與空白組(Con)比較，##P<0.01；與模型組(LPS)比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠BALF中白細(xì)胞情況注：與空白組(Con)比較，## P<0.01；與模型組(LPS)比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠BALF中PMNs情況注：與空白組(Con)比較，## P<0.01；與模型組(LPS)比較，*P<0.05，**P<0.01

3.2 清瘟敗毒飲各拆方組干預(yù)LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠蛋白濃度和肺約濕/干比值情況比較

與空白組對(duì)比，模型組大鼠肺的濕/干比值顯著增大(P<0.01);然而清瘟敗毒飲4個(gè)拆方組能明顯降低肺的濕/干比值(P<0.01)，尤其以C3組最為顯著(圖3)。與空白組比，模型組大鼠BALF中蛋白濃度顯著增加(P<0.01)，然而C1、C2與C3組能明顯降低肺泡灌洗液中蛋白濃度(P<0.05)，尤其以C2組最強(qiáng)(P<0.01)(圖4)。結(jié)果見表1。

3.3 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠TNF-α情況比較

與空白組對(duì)比，模型組大鼠BALF中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)顯著增多(P<0.01)；拆方組中C1、C2和C4TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，尤其以C1組最佳，結(jié)果見表1,圖5。

圖3 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠肺濕/干比情況注：與空白組(Con)比較，## P<0.01；與模型組(LPS)比較，**P<0.01

圖4 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠的蛋白濃度變化注：與空白組(Con)比較，## P<0.01；與模型組(LPS)比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠TNF-α變化注：與空白組(Con)比較，## P<0.01；與模型組(LPS)比較，**P<0.01

3.4 清瘟敗毒飲拆方組改善LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織病理形態(tài)變化情況

圖6顯示,光鏡下空白組見肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄。模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔變窄，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤。拆方組能夠使肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫程度降低、炎性細(xì)胞浸潤減少。

圖6 清瘟敗毒飲拆方組干預(yù)ALI大鼠肺組織病理形態(tài)變化圖(HE,200×)注：空白組(A)；模型組(B)；陽性組(C)；清熱瀉火組(D)；清熱涼血組(E)；清熱燥濕組(F)；其他組(G)

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,ALI患者多由外感時(shí)邪疫毒傷肺[7]，引起肺失宣降，水津不布，導(dǎo)致熱毒痰癖互結(jié)而發(fā)病，病情加重時(shí)由肺累及全身，故可歸于“溫病”“瘟疫”范疇，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)內(nèi)毒素血癥所致ALI認(rèn)識(shí)甚為相似[8]，本病初期多為熱毒壅盛、肺失宣降，而肺不主氣、水凌心肺是本病轉(zhuǎn)危之關(guān)鍵[9]，因此多強(qiáng)調(diào)早期宜清熱解毒為主，對(duì)抗機(jī)體“內(nèi)毒”所產(chǎn)生的損害。

在非典時(shí)期，中醫(yī)診療方案多強(qiáng)調(diào)早期治療應(yīng)清熱解毒為主。根據(jù)臨床運(yùn)用情況，清瘟敗毒飲加減是一種治療臨床疑診或確診SARS患者的有效藥物，可以與西藥合用，作用顯著[3,10]。同時(shí)，中西醫(yī)結(jié)合療法在治療甲型 H1N1 流感合并呼吸窘迫綜合征中即運(yùn)用清瘟敗毒飲加減方劑，療效滿意，且對(duì)患者預(yù)后取得了理想療效[4]。張伯禮[11]總結(jié)一線大夫的經(jīng)驗(yàn)，總體上按衛(wèi)氣營血辨證，認(rèn)為中醫(yī)治療方案的總原則是任何時(shí)期都要注重清熱藥的應(yīng)用。鄧鐵濤[12]在病情極期(高峰期)用白虎加參湯、清營湯、犀角湯等，加用活血化瘀之品，效果顯著。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清瘟敗毒飲拆方后的4個(gè)拆方組,清熱瀉火組、清熱涼血組、清熱燥濕組和其他組，各拆方組均能降低肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫程度以及炎性細(xì)胞的浸潤；但相對(duì)比清熱燥濕組和其他組，清熱瀉火和清熱涼血組均能較好地改善大鼠ALI損傷(P<0.01)，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)清熱法治療ALI作用效果顯著。

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