侯敏娜，何莉，郭颯

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

基金項目：2016年陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No.2961)

作者簡介：侯敏娜(1981-)，女，碩士研究生，講師，主要研究方向：中草藥中活性物質(zhì)研究。

收稿日期：2017-04-06

修回日期：2017-05-01

益母草(LeonurusjaponicusHoutt)是唇形科益母草屬1年生或2年生草本植物，其藥用部位多為益母草新鮮或干燥的地上部分，又稱“莞蔚”。被歷代醫(yī)家譽為“血家圣藥”“經(jīng)產(chǎn)良藥”，是治療婦科疾病之要藥。《本草綱目》云:“益母草行經(jīng)養(yǎng)血，行血而不傷血，養(yǎng)血而不瘀血，誠為血家之圣藥也?！被钚猿煞种饕锌偵飰A，包括益母草堿和水蘇堿等，具有活血調(diào)經(jīng)、利尿消腫、抗炎鎮(zhèn)痛等多種生理活性[1-5]。益母草作為一種傳統(tǒng)的中藥，臨床應(yīng)用廣泛，但存在提取物中的活性成分含量低，藥材及制劑有效成分差異顯著。本次研究意在加快中藥現(xiàn)代化進(jìn)程，提高益母草資源利用效率，探索更先進(jìn)的提取工藝，使益母草劑型多樣化，充分利用益母草這一生物資源，現(xiàn)將研究情況報告如下。

1 材料

1.1 試劑及藥材

益母草(自行收集于陜西延安，經(jīng)我院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為益母草正品)；雷氏銨鹽(北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司)；95%乙醇(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；丙酮(天津市鼎盛鑫化工有限公司)；鹽酸(西安三浦化學(xué)試劑有限公司)；水為純化水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(上海長城制造有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-2電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；FW100粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1 益母草中生物堿的含量測定方法

本實驗采用雷氏鹽比色法進(jìn)行測定[6-7]。原理是利用雷氏鹽在酸性介質(zhì)中可與大部分生物堿生成難溶于水的絡(luò)合物，將生物堿的硫氰酸鉻銨鹽沉淀溶于丙酮中,所得到的紫紅色溶液在波長為510 nm處有最大吸收,可利用公式(1)。

W=A·M·V/ε

(1)

其中，M表示益母草中含量較多的水蘇堿鹽酸鹽(C7H13NO2·HCl)，相對分子質(zhì)量為179.63；ε表示硫氰酸鉻銨在丙酮中的克分子吸收系數(shù)，為106.5；V表示溶解沉淀所取丙酮的毫升數(shù)，為10 ml；測其吸光度A,經(jīng)計算可得到生物堿的含量W(mg)，得率Y可由公式(2)計算。

(2)

2.2 含量測定[8-11]

準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥、粉碎、過80目篩的益母草粉10.0 g，加入一定濃度的適量0.5%鹽酸乙醇溶液,進(jìn)行超聲提取，過濾,濾液水浴蒸干，加入0.1 mol/L HCl溶解,過濾,用等濃度的5 ml HCl洗滌,定容于25 ml容量瓶中。移取6 ml于錐形瓶中,加入0.1 mol/L HCl 6 ml,緩慢滴加新配制的2%雷氏銨鹽溶液6 mL，置冰箱中過夜,抽濾,沉淀用10 ml冷水洗滌至溶液無色,抽干。沉淀加丙酮溶解并定容于10 ml容量瓶中,以丙酮為空白,在最大吸收波長為510 nm處測定吸光度,代入公式(1)、(2)中計算,可得到益母草中總生物堿的得率。

2.3 單因素考察

超聲波輔助提取益母草中生物堿的影響因素主要包括超聲時間、超聲溫度、超聲功率、料液比、乙醇濃度、pH值等。本次研究考察超聲時間、乙醇濃度和料液比這三個因素。

2.3.1 乙醇濃度對益母草中生物堿得率的影響

稱取干燥、粉碎、過80目篩的益母草粉5份，每份10 g，置于250 ml錐形瓶中，依次加入200 ml濃度為50%、60%、70%、80%、90%的0.5%鹽酸乙醇溶液，進(jìn)行超聲提取，超聲功率為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時間為30 min。考察乙醇濃度對益母草生物堿得率的影響，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇濃度對益母草生物堿得率的影響

由圖1可知，益母草生物堿的得率，隨著乙醇濃度的增加，不斷增大。當(dāng)乙醇濃度大于70%時得率也在繼續(xù)增加，但增加的幅度很小。所以，考慮到節(jié)省溶劑資源等原因，我們選取70%乙醇作為益母草生物堿乙醇提取的溶劑濃度。

2.3.2 料液比對益母草中生物堿得率的影響

稱取干燥、粉碎、過80目篩的益母草粉5份，每份10 g，分別加入70%的0.5%鹽酸乙醇溶液140 ml、160 ml、180 ml、200 ml、220 ml，進(jìn)行超聲提取，超聲功率定為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時間為30 min。考察料液比對益母草生物堿得率的影響，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對益母草生物堿得率的影響

由圖2可知，益母草生物堿得率隨著料液比的增加呈不斷增大趨勢。當(dāng)達(dá)到18 BV時得率也在繼續(xù)增加，但增加的幅度很小。所以，綜合考慮各方面原因，選取料液比為18 BV，作為益母草生物堿乙醇提取的溶劑用量。

2.3.3 超聲時間對益母草中生物堿得率的影響

稱取干燥、粉碎、過80目篩的益母草粉5份，每份10 g，分別加入70%的0.5%鹽酸乙醇180 ml，進(jìn)行超聲提取，超聲功率為180 W，超聲溫度為40℃，超聲時間分別為30 min、35 min、40 min、45 min、50 min?？疾斐晻r間對益母草生物堿得率的影響，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對益母草生物堿得率的影響

由圖3可知，在30～50 min內(nèi)，隨著時間的增加，得率也增加，但時間超過40 min后，隨著時間繼續(xù)增加，得率開始逐漸降低，表明益母草生物堿得率并不會隨著時間的增加而無限增加，而在40 min時達(dá)到最高值。

2.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)曲面優(yōu)選分析

在單因素的實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)因素水平表1，按照響應(yīng)曲面Box-Behnken的設(shè)計原理，共有17組實驗，其實驗結(jié)果如表1～2。

表1 因素水平表

表2 實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

對該模型進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

注：*P<0.05顯著;**P<0.01高度顯著;***P<0.001極其顯著

通過Design-Expert8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到益母草生物堿得率對乙醇濃度(A)，提取時間(B)，料液比(C)的二次多元回歸方程。

得率：

Y=-2.503 13+0.013 475A+0.047 775B+0.135 69C+2.500 0E-005AB-8.750 00E-005AC-1.500 00E-004BC-8.750 00E-005A2-5.800 00E-004B2-3.375 00E-003C2

對該模型數(shù)據(jù)，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P值(<0.000 1)及F值(119.70>0.05)，說明本次實驗選用的二次多項式模型極為顯著。同時失擬項F=0.317 7>0.05，表明失擬項不顯著，可以對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測，實驗方案設(shè)計合理正確。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)實驗結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件，繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見圖4、圖5、圖6。

圖4 乙醇濃度與超聲時間的三維圖和等高線

圖4為乙醇濃度與超聲時間對益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖4可以看出，當(dāng)料液比一定時，益母草中總生物堿得率隨著乙醇濃度增加呈增加趨勢，但達(dá)到70%時，坡面增加的幅度較緩；超聲時間不斷延長，得率也在上升，但是在40 min后，呈下降趨勢，且整個坡度比乙醇濃度的坡面要陡，說明得率受超聲時間二次項的影響比乙醇濃度大。由圖4可以確定最佳參數(shù)范圍：乙醇濃度72%～76%，超聲時間38～42 min。在此范圍內(nèi)益母草中總生物堿得率最大。

圖5 乙醇濃度和料液比的三維圖和等高線

圖5為料液比和乙醇濃度對益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖5可以看出料液比的坡面比乙醇濃度的坡面陡，表明料液比的二次項對益母草中總生物堿得率具有明顯影響，而乙醇濃度對其影響較小。由圖5可以確定兩因素最佳參數(shù)范圍：乙醇濃度72%～76%，料液比為1∶17～1∶19。在此范圍內(nèi)的益母草中總生物堿得率最大。

圖6 料液比與超聲時間的三維圖和等高線

圖6為料液比與超聲時間對益母草中總生物堿得率的響應(yīng)曲面圖，由圖6可以看出料液比與超聲時間的坡面都比較陡，說明他們的二次項對益母草中總生物堿得率的影響都比較顯著，等高線趨于橢圓，說明超聲時間與料液比的交互項對益母草中總生物堿得率的影響顯著。由圖6可以確定兩因素的最佳參數(shù)范圍：料液比1∶17～1∶19，超聲時間38～42 min。

由此可知，優(yōu)選的益母草中總生物堿提取工藝為：料液比為1∶18.25，提取時間為40.14 min，乙醇濃度為73.63%，在此條件下，益母草中總生物堿預(yù)測值為0.196 53%。綜合考慮各方面因素，將實驗參數(shù)修正為：料液比為1∶18，提取時間為40 min，乙醇濃度為74%，平行3次實驗，經(jīng)計算平均得率為0.195 27%，與理論值相差0.001 26%。因此，本方法確定的益母草中總生物堿提取工藝參數(shù)可靠，并且有一定的實際參考價值。

3 結(jié)論

通過單因素實驗，運用響應(yīng)曲面法，優(yōu)化益母草中總生物堿的超聲提取工藝參數(shù)，經(jīng)綜合考慮修正，最終優(yōu)化條件為：料液比為1:18，提取時間為40 min，乙醇濃度為74%，此時益母草中總生物堿得率為0.195 27%。通過回歸分析及驗證實驗，證明了該響應(yīng)面法的合理性、可行性，可為益母草資源的開發(fā)及合理利用提供依據(jù)。

[1] 周本宏,馬郁文,羅毅.超聲提取益母草總堿的工藝優(yōu)選[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2006,25(5): 451-452.

[2] ZHOU Ben-hong,MA Yu-wen,LUO Yi.Technology Optimizationfor U ltrasonic Ectraction of Total Alkaloids from Leonurus[J].Herald of Medicine,2006,25(5): 451-452．

[3] 李煥杰,孟祥云.不同溶劑及方法對益母草生物堿含量影響[J].陜西中醫(yī),2008,29(5):607-608.

[4] 徐冰,李寶泉,馬勇.益母草有效成分的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2003,15(3):68-70.

[5] 李萬,蔡亞玲.益母草總生物堿的藥理實驗研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2002,31(2):168-170.

[6] 徐小華,杜紹亮,楊云.益母草中總生物堿的提取及含量測定[J].河南科學(xué),2008,26(12):1481-1483.

[7] 李林.水蘇堿的研究概況[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(3):930-931.

[8] 嚴(yán)優(yōu)芍.益母草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、提取工藝和劑型的改進(jìn)研究[D].廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué),2005:19-23.

[9] 晁志,王厄舟,周秀佳.益母草藥材中生物堿含量與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的關(guān)系[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2000,20(6):504-506.

[10] 周文華,楊輝榮,岳慶磊.生物堿提取和分離方法的研究新進(jìn)展[J].當(dāng)代化工,2003,5(2):54-57.

[11] 喻朝陽,王曉琳.生物堿提取與純化技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2006,25(3):259-261.