靳昭輝，高普，宋光熠，劉征堂，靳冰*，相田園

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091;2.遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，遼寧 沈陽 110005)

糖尿病在社會疾病中占有越來越大的比例,至2035年,預(yù)計全球患糖尿病總?cè)丝趯⒊^5.9億[1]。糖尿病動脈粥樣硬化(diabetic atherosclerosis,DA)是一種獨立的糖尿病并發(fā)癥,危害極大。血管內(nèi)皮損傷是DA發(fā)生、發(fā)展的核心機制之一[2]。

高糖狀態(tài)下，體內(nèi)蛋白質(zhì)與還原糖可以在非酶條件下發(fā)生反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價化合物，即晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)，AGEs活化晚期糖基化產(chǎn)物受體(RAGE)，從而激活p38MAPK信號傳導(dǎo)通路,引起級聯(lián)反應(yīng)，從而引起/促進血管內(nèi)皮損傷[3]。

本課題所采用的中藥組分冬連三七組分(麥冬多糖40%,黃連生物堿30%,三七總皂苷30%)是3味中藥主要有效成分的組方,在前期研究中,已經(jīng)使每味中藥有效成分的提純含量達到90%以上,經(jīng)過反復(fù)測驗優(yōu)選配伍的比例,目前已是實驗用藥的最佳配伍方案。

我們在前期4項國家自然科學(xué)基金課題研究中發(fā)現(xiàn)[4-15],CONR能夠調(diào)控降低DA大兔血糖相關(guān)指標，降低組織中AGEs、RAGE的含量，調(diào)整脂質(zhì)代謝紊亂，有效減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的內(nèi)皮細胞、血管及微血管、臟器組織的損傷。

本實驗研究了CONR調(diào)控AGEs/p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對DA大兔血管內(nèi)皮損傷的作用，并對其機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性純種新西蘭大白兔(遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，SCXK(遼)2010-0001),體質(zhì)量(2.5±0.3)kg。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,單籠喂養(yǎng),自由飲食,溫度(22±2)℃,濕度(70±5)%。

1.2 藥物

CONR(北京同仁堂藥業(yè)公司)；辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司,批號140213)；四氧嘧啶(BDH Limited Poole England,5272460J)；SB203580(Calbiochem公司)。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 主要試劑

鼠抗兔p-p38MAPK抗體(Sigma);羊抗兔IgG、GAPDH羊抗兔、HPR(北京天德悅);SA 標準品(Sigma);蛋白抽提試劑,Millipore 2 mg/ml;BCA蛋白定量試劑盒(Pierce); 5×還原樣品緩沖液、10×TBST pH值8.0、濕轉(zhuǎn)緩沖液B、10×Tris-Glycine-SDS (賽諾博); NC膜,0.45 μm孔徑( Millipore);考馬斯亮藍G-250(Appli Chem);中分子量預(yù)染蛋白Marker (Fermentas);Bis-Acrylamide、Tween-20、TEMED (Pierce);α-actinin、Trizma base、NP-40Glycine (Sigma);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Roche);麗春紅染色液、Ponceau S、DTT、Stripping Buffer、Bromphenol Blue、PMSFAcrylamide、APS(AMRESCO)。

1.3.2 主要儀器

倒置相差顯微鏡;CO2培養(yǎng)箱;超凈工作臺;37℃恒溫箱;超低溫冰箱;酶標分析儀;優(yōu)普超純水機;激光共聚焦掃描顯微鏡;全自動生化分析儀、微量加樣器;濕盒;凝膠成像系統(tǒng);紫外/可見分光光度計;酶標儀;低溫離心機(Thermo);MiniP-4、濕轉(zhuǎn)電泳槽(Cavoy);酸度計PH211(Hanna);半干槽、電泳儀(伯樂生命);水平脫色搖床、電動組織勻漿儀(上海琪特)。

1.4 實驗方法

1.4.1 DA大兔模型制備

雄性新西蘭大白兔隨機取10只作為空白組,其余50只兔耳緣靜脈推注無菌生理鹽水配制的5%四氧嘧啶(100 mg/(kg·bw))[16-17],6 h和12 h腹腔注射10%葡萄糖10 ml/只,72 h后測FBG,選取13.5 mmol/L≤FBG≤23.5 mmol/L作為模型兔?？瞻捉M喂食普通飼料30 g/(kg·d),每日分4餐喂養(yǎng)。模型兔喂高脂飼料(含2%膽固醇、0.5%膽酸和5%豬

油)30 g/(kg·d);1周后實驗各組在40 mg/(kg·bw)戊巴比妥鈉麻醉下球囊導(dǎo)管行腹主動脈內(nèi)膜球囊損傷術(shù)[16，18],術(shù)后各實驗組分別每日給予CONR 450 mg/kg、CONR 150 mg/kg、辛伐他汀3 mg/kg灌胃;SB203580 2 mg/kg腹腔注射[19],12 h重復(fù)給藥。每日給予空白組生理鹽水20 ml。10周后,于最后1次灌藥/腹腔注射l h后(灌藥/腹腔前禁食不禁水12 h),腹主動脈采血[20],無菌分離血清,經(jīng)56℃,30 min滅活處理后,-20℃保存?zhèn)溆?取左心室組織備用。

1.4.2 ELISA法測定血清中AGEs、FBG、NO、ET含量嚴格按照說明書操作。

1.4.3 WesternBlotting 法測定各組p-p38MAPK蛋白含量

提取心肌細胞總蛋白,BCA法定量。-20℃保存。取70 μgDA兔的心肌細胞樣品,進行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,搖勻(4℃,過夜),加入封閉液和適當(dāng)?shù)囊豢?用TBST沖洗濾膜4次,10 min/次,加入二抗,室溫孵育60 min,用TBST沖洗3次,每次10 min。PVDF膜上加入顯影液,室溫下停放1 min。用保鮮膜包裝(盡量避免氣泡)。 以α-肌動蛋白為內(nèi)參，用ODYSSEY紅外凝膠掃描系統(tǒng)定量分析各條帶的總灰度值。

1.4.4 HE染色觀察血管病理圖

將固定好的標本乙醇脫水，石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片，進行HE染色，在光鏡下觀測病理變化和主動脈血管病變情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 冬連三七組分對糖尿病動脈硬化兔空腹血糖的影響

結(jié)果見表1。CONR高、CONR低劑量組對FBG均有降低作用,顯著低于模型組(P<0.01);而SB203580組、辛伐他汀組對DA兔的FBG無明顯降低作用(P>0.05)。

表1 冬連三七組分對糖尿病兔空腹血糖FBG的影響

注：與模型組比較，*P<0.01;與空白組比較，△P<0.01

2.2 DA兔模型建立情況

分別選取并處死1只正常兔、2只模型兔,取胸主動脈。主動脈病變分布情況:空白對照組無病變,模型組胸主動脈內(nèi)膜有許多黃白色或橙紅色條紋凸起,病變嚴重,大部分主動脈有斑塊覆蓋。

2.3 ELISA法測定血清中AGEs、ET、NO含量

CONR高劑量組、CONR低劑量組、SB203580組對AGEs均有降低作用,與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CONR高CONR低劑量組、劑量組、SB203580組及辛伐他汀組對DA大兔的ET有降低作用(P<0.01);各實驗組NO活性較模型組顯著增強(P<0.01)。詳見表2。

2.4 Western Blotting法測DA兔心肌細胞p-p38MAPK蛋白含量的表達

模型組較空白組心肌p-p38MAPK蛋白表達升高,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。各實驗組較模型組對p-p38MAPK蛋白表達均有抑制作用(P<0.01)。CONR高劑量組、辛伐他汀組對p-p38MAPK蛋白的抑制作用優(yōu)于SB203580組(P<0.01),CONR高劑量組和辛伐他汀組之間對p-p38MAPK蛋白的抑制作用無差異(P>0.05)。詳見表2,圖1。

表2 CONR對DA兔AGEs、NO、ET及p-p38MAPK蛋白的影響

注：與模型組比較，*P<0.01；與空白組比較，#P<0.01；與SB203580組比較，△P<0.01;蛋白質(zhì)內(nèi)參GAPDH。

圖1 CONR對DA兔心肌細胞p-p38MAPK蛋白的表達注：A.空白對照組，B.模型對照組，C.CONR高劑量組，D.CONR低劑量組，E.SB203580組，F(xiàn).辛伐他汀組

2.5 CONR對DA大兔主動脈病理的影響

模型組兔胸主動脈血管壁彌漫性隆起，突向管腔，內(nèi)膜下有較多泡沫細胞、極少量纖維母細胞和膠原，中層平滑肌明顯增生，并有炎細胞浸潤;空白對照組兔胸主動脈動管壁三層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌排列整齊未見病理改變。藥物干預(yù)各組在炎性細胞浸潤，血管內(nèi)皮損傷程度等方面明顯減輕。結(jié)果見圖2。

圖2 CONR對DA大兔主動脈病理的影響(HE,400×)

3 討論

3.1 糖尿病動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷機制

糖尿病動脈粥樣硬化是其慢性并發(fā)癥的基本病理改變之一。血管內(nèi)皮損傷在糖尿病動脈粥樣硬化發(fā)病過程中作用非常重要。

隨著近年來研究的深入，許多研究表明糖尿病血管并發(fā)癥與自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化有關(guān)，糖尿病動脈硬化的產(chǎn)生機制、發(fā)展過程和血管內(nèi)皮損傷均有密切的關(guān)系，NO、ET能有效反映血管損傷水平[21]。

高血糖狀態(tài)下，長期的代謝失衡產(chǎn)生大量的氧自由基(ROS)[22-23]，ROS可以通過AGEs等多種途徑和直接作用引起血管內(nèi)皮損傷[24-25]，導(dǎo)致血管病變并產(chǎn)生并發(fā)癥。

本次研究結(jié)果顯示，四氧嘧啶配合腹主動脈內(nèi)膜球囊損傷術(shù)誘導(dǎo)雄性純種新西蘭大白兔的DA模型有著相對較高的ET，而NO水平相對較低，提示血管內(nèi)皮細胞損傷增加;并且還發(fā)現(xiàn)DA兔主動脈內(nèi)皮細胞腫脹，血管壁彌漫性隆起，凸向管腔，內(nèi)膜下有較多泡沫細胞,極少量纖維母細胞和膠原，并有炎細胞浸潤，主動脈內(nèi)膜增厚，表明血管內(nèi)皮損傷及持續(xù)高糖狀態(tài)能促進DA的形成。

3.2 AGES/p38MAPK與糖尿病動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮損傷

葡萄糖和蛋白質(zhì)結(jié)合能形成AGEs,在高血糖條件下,蛋白質(zhì)的非酶促糖化增加,最終導(dǎo)致不可逆的晚期AGEs生成增加。AGEs與特異受體RAGE結(jié)合,RAGE作為一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體,可通過激活MAPK等信號通路[26],使活性氧基團產(chǎn)生增多從而參與血管內(nèi)皮損傷[27-28]。

p38MAPK是MAPKs超家族成員之一,有研究發(fā)現(xiàn)[29],p38MAPK可導(dǎo)致和加速血管內(nèi)皮損傷,是血管內(nèi)皮損傷過程的重要調(diào)節(jié)蛋白,在糖尿病并發(fā)癥的形成中起重要作用。

作為p38MAPK特異性抑制劑,SB203580能抑制p38MAPK通路及其后續(xù)的級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[30]。模型組p-p38MAPK蛋白呈現(xiàn)高表達,CONR各組及SB203580組對p-p38MAPK蛋白體現(xiàn)出部分抑制作用,表明p38MAPK通路激活確實參與了DA兔血管內(nèi)皮損傷過程。

3.3 中藥配伍組分治療DA的理論依據(jù)

中醫(yī)學(xué)認為,DA的發(fā)病由多種因素參與,導(dǎo)致陰虛燥熱兼有血瘀,這也是消渴病及其并發(fā)癥的主要病機。依據(jù)這一理論,以滋陰清熱、活血祛瘀為機理,結(jié)合現(xiàn)代研究進展,創(chuàng)建了冬連三七組分,由黃連生物堿、三七總皂苷、麥冬多糖組成。

黃連生物堿能促進葡萄糖酵解,胰島β細胞功能恢復(fù)和再生,增強胰島素敏感性，降低胰高血糖素水平[31],增加SOD活性,抑制p38MAPK,改善氧化應(yīng)激反應(yīng)[32]。麥冬多糖可以降低血糖、降低胰島素的敏感性,可能與其有效改善氧化應(yīng)激有關(guān)[33]。三七總皂苷具有抗氧化應(yīng)激、影響自由基生成、改善微循環(huán)、增強免疫力等藥理作用[34-36]。

冬連三七組分對糖尿病動脈粥樣硬化兔模型具有防治作用。CONR可降低DA兔血糖水平,降低AGEs的過量產(chǎn)生,抑制p-p38MAPK蛋白高表達,降低其血清ET血管內(nèi)皮損傷因子水平,升高血管內(nèi)皮保護因子NO水平。進而提示,中藥配伍組分可能部分通過調(diào)控AGEs/p38MAPK信號傳導(dǎo)通路抑制血管內(nèi)皮損傷進而控制DA的發(fā)生發(fā)展過程。

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