趙伯辰，張 柯，雷宏杰，徐懷德

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

啤酒高濃釀造不僅會(huì)產(chǎn)生很大的經(jīng)濟(jì)效益，在一定程度上還可提高啤酒的質(zhì)量[1]。18°P麥汁發(fā)酵的高級(jí)醇生成量顯著高于12°P麥汁發(fā)酵的高級(jí)醇生成量，醇酯比增大[2]。這樣，將高濃發(fā)酵后的啤酒稀釋至常濃時(shí)，依然可保證啤酒豐滿圓潤，口感柔和協(xié)調(diào)。但是，高濃釀造在生產(chǎn)中也存在許多問題，如：高濃形成的高滲透壓和高乙醇毒性抑制酵母的生長，使得發(fā)酵緩慢[3-6]，增加了酵母壓力；降低了原料的利用率（酒花的利用率下降）和啤酒泡沫穩(wěn)定性[7]；造成啤酒風(fēng)味差異，不協(xié)調(diào)[8-9]；影響了酵母的發(fā)酵性狀和絮凝性等[10]，并降低了酵母回收再利用率。產(chǎn)生這些不良效果的根本原因在于發(fā)酵過程中可同化氮源的不足。

氮源作為酵母細(xì)胞生長和代謝所必需的元素之一，在酵母生長、繁殖過程中扮演著重要的角色。酵母的生長伴隨著氮源的消耗，酵母停止繁殖，氮源的利用就會(huì)相應(yīng)降低甚至停滯。高濃麥汁中α-氨基氮的含量不僅對(duì)酵母適應(yīng)高滲透壓有影響，還會(huì)對(duì)乙醇生產(chǎn)速率和乙醇耐受性有一定的影響，高濃度的α-氨基氮可增加酵母對(duì)高滲透壓的適應(yīng)能力和乙醇的耐受性。酵母細(xì)胞的氮代謝活動(dòng)主要有胞內(nèi)氨基酸的生物合成和結(jié)構(gòu)蛋白及各種酶類的合成等[11]。在發(fā)酵初期，麥汁中大量的含氮物質(zhì)被快速利用，24 h之后利用變緩，直至酵母細(xì)胞停止生長[12]。常濃釀造麥汁中總FAN水平與酵母生長成正比，即麥汁中高的FAN水平可導(dǎo)致酵母細(xì)胞的快速增長，并影響啤酒的成熟[13]，初始FAN水平與最終乙醇產(chǎn)量之間也存在顯著相關(guān)性[14]。因此，確保麥汁中豐富的FAN對(duì)于良好及快速的發(fā)酵具有非常重要的意義。氨基酸作為重要的可同化氮源不僅參與細(xì)胞內(nèi)各物質(zhì)的代謝[15]并提高啤酒非生物穩(wěn)定性，而且部分氨基酸還可調(diào)控啤酒酵母細(xì)胞適應(yīng)高滲透壓和高乙醇毒性，從而提高酵母的發(fā)酵性能。

本試驗(yàn)研究不同濃度全麥芽麥汁，即不同氮源水平對(duì)啤酒酵母生理特性和發(fā)酵性能的影響，探究啤酒高濃釀造中豐富的氮源與酵母生長、細(xì)胞活性、乙醇產(chǎn)量、發(fā)酵度及其與啤酒風(fēng)味物質(zhì)等的關(guān)系，確定在高濃釀造中能夠調(diào)控酵母細(xì)胞適應(yīng)高滲透壓環(huán)境脅迫的關(guān)鍵氨基酸。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：Lager啤酒酵母Saccharomyces pastorianus，由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品工程實(shí)驗(yàn)室提供。該菌種經(jīng)UV照射和甲基磺酸乙酯復(fù)合誘變后在含有高濃度麥芽糖和乙醇的培養(yǎng)基上進(jìn)行馴化培養(yǎng)獲得。

麥汁制備：稱取一定量的麥芽（澳麥芽，購買于廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司），經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后裝入糖化鍋內(nèi)，按照麥芽與水的質(zhì)量比為1∶4加入45℃釀造水，攪拌均勻，用乳酸調(diào)至pH5.5。設(shè)置升溫程序依次為：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72℃，10 min；78℃，10 min。以1℃/min的速度升溫，開始糖化，糖化結(jié)束后迅速冷卻至45℃進(jìn)行濾布過濾，再將濾液煮沸90 min，煮沸過程中分3次添加酒花顆粒（由西安雪花啤酒有限公司提供），添加量為麥芽質(zhì)量的0.1%。煮沸結(jié)束后再次用紗布過濾，將濾液用釀造水分別定型至8 °P、12 °P、16 °P、20°P、24°P，得到不同濃度的全麥芽麥汁。發(fā)酵前進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121℃，15 min）。

試劑：果糖、瓊脂、麥芽糖漿，厚樸生物科技（蘇州）有限公司；高級(jí)醇酯標(biāo)準(zhǔn)品、甘氨酸，美國Gen-Probe公司；亞甲基藍(lán)、茚三酮，南京化學(xué)試劑股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：ISQ&TRACE ISQ氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛科技有限公司；Waters UPLCI-Class型高效液相色譜儀，美國沃特斯公司；DYJX-80℃冰箱，鼎耀機(jī)械有限公司；UV1780紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；TS-1102C小型立式恒溫振蕩箱，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制有限公司；XP6電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；860型粉碎機(jī)，南京威利朗是食品機(jī)械有限公司；E100LED MV生物顯微鏡，日本尼康公司；BSD-150搖床培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；ATAGO（愛拓）糖度計(jì)，廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；YX-280高壓滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；CM-5色差計(jì)，科電貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母種子擴(kuò)培和啤酒發(fā)酵

在無菌條件下，用接種環(huán)從試管斜面上刮取1環(huán)酵母，接種于10 mL 12°P全麥芽麥汁種子培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)24 h（25 ℃，180 r/min），之后轉(zhuǎn)入200 mL種子液（12°P全麥芽麥汁）中，搖床培養(yǎng)48 h（20℃，120 r/min），最后，轉(zhuǎn)入1 L種子液中，15℃靜置培養(yǎng)72 h。離心取酵母泥（8000 g，10 min，4 ℃）。接種量5× 106cells/mL/°P。

采用2 L錐形瓶進(jìn)行啤酒發(fā)酵，裝無菌麥汁量為1.0 L。發(fā)酵溫度為15℃。每天定時(shí)取樣，發(fā)酵液和酵母菌體經(jīng)離心分離（8000 g，15 min，4℃），將上清液置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞率

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測定懸浮酵母細(xì)胞數(shù)量和活細(xì)胞率（亞甲基藍(lán)染色）。將從錐形瓶中取出的樣液稀釋10倍后測定其懸浮細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞率。在0.1 mL細(xì)胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸鹽亞甲基藍(lán)溶液（pH4.6），振蕩混勻，10 min后在電子顯微鏡下通過血球計(jì)數(shù)板對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞（死亡的細(xì)胞被染成了藍(lán)色）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 麥汁濃度和酒精度測定

將發(fā)酵后的麥汁離心取上清液（8000 g，15 min，4℃）30 mL，倒入25 mL的附溫比重瓶中，將附溫比重瓶置于20℃水浴中，待溫度升到20℃，快速取出，稱其重量，測定其在20℃條件下的浸出物含量。麥汁濃度用“°P”表示，即100 mL麥汁中含有浸出物的固形物的量（g）。

將發(fā)酵后的麥汁離心取上清液50 mL，倒入500 mL蒸餾瓶中，再加入50 mL去離子水，加熱蒸餾。用50 mL的容量瓶收集餾出液，當(dāng)餾出液體積接近50 mL時(shí)，停止蒸餾，用蒸餾水定容至50 mL。用附溫比重瓶測定其在20℃條件下的乙醇濃度。

1.2.4 麥汁FAN測定

麥汁的FAN水平測定采用茚三酮顯色法[16]。制備甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L、160μmol/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。麥汁樣品稀釋100倍，首先在具塞玻璃試管中加入2.0 mL的稀釋樣品，然后加入1.0 mL的顯色劑（0.5 g茚三酮、10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4和0.3 g果糖溶于100 mL去離子水，pH 6.7）；再將試管放進(jìn)100℃沸水浴中，反應(yīng)時(shí)間為16 min，然后20℃恒溫水浴下冷卻20 min，待冷卻完成后加入5.0 mL的稀釋劑（2.0 g KIO3溶于1 L的40%乙醇水溶液），用旋渦振蕩器混勻，靜置15 min；最后在波長570 nm條件下檢測樣品吸光值。計(jì)算公式如下：

1.2.5 麥汁游離氨基酸測定

首先要將樣品進(jìn)行前處理：啤酒樣品超聲脫氣后，0.45 μm濾膜過濾。

衍生劑的配制：吸取1 mL AccQ·Fluor稀釋劑（2B瓶）放入裝有AccQ·Fluor衍生劑粉末的2A瓶中，加蓋密封，旋渦振蕩10 s；在加熱裝置上加熱2A瓶，直至AccQ·Fluor衍生劑粉末全部溶解，加熱時(shí)間不超過10 min，溫度不超過55℃。

氨基酸的衍生方法：取20 μL的18種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（AA）混合液放入6×50 mm樣品管中，再加入60 μL硼酸緩沖液（1瓶）到樣品管中，渦旋混合；待混合均勻，在上述樣品管中加入20 μL配制好的AccQ·Fluor衍生試劑，立即渦旋混合數(shù)秒鐘，放置1 min。然后將樣品管中的反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到一只微量樣品瓶中，加蓋密封，在55℃的加熱裝置中加熱10 min。

色譜條件：色譜柱為Waters公司的C18氨基酸專用分析色譜柱；柱溫：37℃；DAD檢測波長為248 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A：醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相C：超純水。外標(biāo)法定量。

1.2.6 啤酒風(fēng)味物質(zhì)測定

在測定前將樣品放置在4℃條件下保存，主要是為了防止殘留酵母細(xì)胞的生長和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)。在氣質(zhì)萃取瓶中加入12 mL樣品和3 g NaCl，接著用PTFE-silicone瓶蓋密封后進(jìn)行HSSPME-GC-MS分析。色譜條件：采用60μm CARPDMS萃取頭，將裝有樣品的萃取瓶在45℃下平衡15 min，頂空萃取30 min。柱型采用DB-Wax毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），載氣：氦氣，流速：1.0 mL/min，分流比：20∶1。升溫程序：40 ℃，保持2 min，然后以6℃/min的速度升溫至230℃，保溫3 min。進(jìn)樣口溫度為230℃。質(zhì)譜條件：離子源溫度為240℃，電離方式EI，電離電壓70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～450 u?；衔镨b定采用計(jì)算機(jī)譜庫（NIST2011譜庫）檢驗(yàn)分析，進(jìn)行定性，用內(nèi)標(biāo)正辛醇定量，所得風(fēng)味物質(zhì)為相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的含量。

1.2.7 麥汁發(fā)酵度的計(jì)算

麥汁發(fā)酵度是啤酒發(fā)酵過程中麥汁固形物被酵母消耗的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值，采用Minitab 16進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，SPSS 20進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多重比較采用Tukey法，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同麥汁濃度對(duì)酵母生長和活細(xì)胞率的影響

酵母細(xì)胞數(shù)反映的是酵母生長的狀況，酵母活細(xì)胞率則表示了環(huán)境中酵母新陳代謝的整體能力。由圖1A可知，不同氮源水平的麥汁中，懸浮酵母細(xì)胞數(shù)在發(fā)酵初期快速增加，高濃20°P和24°P在發(fā)酵第1天中，增加速度均低于其他濃度麥汁，這可能是高滲透壓導(dǎo)致酵母細(xì)胞生長在發(fā)酵初始階段產(chǎn)生一個(gè)短暫的延滯期。在發(fā)酵第2天懸浮細(xì)胞數(shù)最多，酵母凈生長量隨著麥汁濃度的增大而減小，這是因?yàn)楦邼B透壓抑制了酵母生長。在第2天后，因?yàn)榻湍讣?xì)胞的絮凝導(dǎo)致懸浮酵母細(xì)胞數(shù)逐漸下降。酵母絮凝性是啤酒酵母的一個(gè)重要特性，在生產(chǎn)過程中絮凝性的強(qiáng)弱不僅可控制啤酒的發(fā)酵周期、過濾性能等，而且會(huì)對(duì)啤酒的風(fēng)味產(chǎn)生影響，這在生產(chǎn)上具有特殊意義，酵母絮凝性也是區(qū)別酵母菌株的一項(xiàng)重要指標(biāo)[17-18]。主發(fā)酵溫度一定時(shí)，原麥汁濃度對(duì)酵母絮凝性影響較大，原麥汁濃度越高，酵母絮凝性越低[19]。發(fā)酵2 d后，16°P、20°P、24°P高濃麥汁中的懸浮酵母數(shù)總是多于8°P低濃和12°P常濃中的懸浮酵母數(shù)，這是由環(huán)境中豐富的氮源對(duì)細(xì)胞生長的促進(jìn)作用所導(dǎo)致?？梢?，豐富的FAN增強(qiáng)了酵母細(xì)胞活性、促進(jìn)了酵母后期的生長，從而緩解了高滲透壓對(duì)酵母細(xì)胞的脅迫作用[20]。

酵母活細(xì)胞率的變化如圖1B，同懸浮酵母細(xì)胞數(shù)變化規(guī)律相似，呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵第2天活細(xì)胞率最大，且麥汁濃度增大，活細(xì)胞率顯著降低；在發(fā)酵第2天后，8°P和12°P麥汁中活細(xì)胞率均大于高濃麥汁；在發(fā)酵進(jìn)入末期之前，所有試驗(yàn)組的酵母活細(xì)胞率均保持在較高水平（≥95%），發(fā)酵后期有所降低；當(dāng)麥汁濃度≤16°P時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后活細(xì)胞率仍保持在90%以上，20°P和24°P麥汁中的活細(xì)胞率在發(fā)酵末期顯著下降，尤其是24°P麥汁，最后的活細(xì)胞率低于80%，這是因?yàn)槔鄯e的高乙醇對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用[21]。

圖1 發(fā)酵過程中懸浮酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)（A）和活細(xì)胞率（B）的變化

2.2 不同濃度麥汁發(fā)酵過程中FAN的消耗情況

FAN含量的高低作為一個(gè)重要的指標(biāo)，反映了酵母在生長繁殖、新陳代謝等過程中對(duì)環(huán)境中氮源的需求。有報(bào)道指出，F(xiàn)AN消耗主要集中在酵母細(xì)胞的生長對(duì)數(shù)期，而在穩(wěn)定期和衰亡期消耗很低[22]。發(fā)酵過程中游離氨基氮水平的變化情況見圖2。由圖2可知，在不同濃度麥汁發(fā)酵過程中，F(xiàn)AN水平的變化趨勢一致，酵母對(duì)FAN的快速吸收主要集中在接種后的24 h內(nèi)。在發(fā)酵2 d時(shí)，F(xiàn)AN水平逐漸升高，之后依次呈現(xiàn)降低、升高的波動(dòng)趨勢，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是：營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，酵母細(xì)胞在緩慢吸收氮源的同時(shí)也在代謝產(chǎn)氮，在發(fā)酵24 h前處于酵母細(xì)胞生長的對(duì)數(shù)期，大量的FAN被酵母細(xì)胞吸收用于自身的生長繁殖，在約24 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，活細(xì)胞數(shù)最大，酵母細(xì)胞對(duì)FAN的消耗趨于平穩(wěn)降低，酵母細(xì)胞代謝產(chǎn)物中的氮源與酵母吸收利用的可同化氮源幾乎相等，使環(huán)境中的FAN水平趨于不變，此時(shí)的FAN水平最低，在24 h后，隨著發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行，環(huán)境中可利用的氮源缺乏及酵母生長進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，使酵母細(xì)胞代謝釋放到環(huán)境中的氮源水平高于吸收的氮源水平，故發(fā)酵環(huán)境中的FAN水平呈現(xiàn)上升趨勢。在發(fā)酵末期，8°P和12°P麥汁中的FAN水平不再有明顯的變化，而16°P、20°P、24°P高濃麥汁中FAN水平持續(xù)上升，是因?yàn)榘l(fā)酵后期乙醇的大量積累對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，致使酵母細(xì)胞生理和結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量的氮源被釋放出來；并且麥汁濃度越高，F(xiàn)AN水平升高幅度越大，說明發(fā)酵末期乙醇累積量越大，對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用和細(xì)胞被損壞的程度也就越大，釋放到環(huán)境中的FAN就會(huì)越多。由圖2也可看出，高濃麥汁發(fā)酵不僅延長了發(fā)酵時(shí)間，而且也增加了FAN的消耗量（8°P麥汁中FAN的消耗量為386.84 mg/L，12°P的為507.74 mg/L，16°P的為599.28 mg/L，20°P的為638.78 mg/L，24°P的為623.11 mg/L）。

2.3 不同麥汁濃度對(duì)酵母發(fā)酵度的影響

圖2 發(fā)酵過程中游離氨基氮水平的變化

麥汁發(fā)酵度反映了酵母對(duì)糖的利用情況，麥汁發(fā)酵度越高,表明酵母對(duì)糖的利用越充分，則環(huán)境中殘留的糖就會(huì)越少。糖的不完全利用會(huì)導(dǎo)致腐敗微生物的生長從而增大了啤酒受污染的風(fēng)險(xiǎn)[23]。在本研究中，常濃12°P麥汁的發(fā)酵度最大，為86%（圖3），8°P麥汁的發(fā)酵度有所降低（84.29%），這可能是由于較低的氮源水平導(dǎo)致細(xì)胞生長速度緩慢，降低了細(xì)胞對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率[23]。16 °P、20 °P、24 °P麥汁的發(fā)酵度分別為85.83%、82.5%和81.98%，在高濃條件下，麥汁濃度越高，發(fā)酵度越低，這可能是因?yàn)楦邼B透壓引起酵母活性發(fā)生改變、降低了發(fā)酵速率[24]，另一個(gè)原因是發(fā)酵后期的高乙醇濃度影響了酵母細(xì)胞活性、降低了細(xì)胞對(duì)糖的轉(zhuǎn)化速率[25]。然而12°P常濃麥汁與16°P高濃麥汁的發(fā)酵度之間沒有顯著性差異（P＞0.05），這是因?yàn)楦叩腇AN水平改善了酵母細(xì)胞生長率和發(fā)酵度[14]，豐富的FAN調(diào)控酵母細(xì)胞適應(yīng)了高滲透壓和其他環(huán)境脅迫，使得發(fā)酵初期高的糖濃度所形成的高滲透壓未能對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生很大的影響，從而未能明顯地抑制發(fā)酵。24°P超高濃麥汁和12°P常濃麥汁的發(fā)酵度之間存在顯著性差異（P＜0.05），這是發(fā)酵后期高乙醇濃度所致[26]。

圖3 不同麥汁濃度對(duì)發(fā)酵度的影響

2.4 不同麥汁濃度對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響

乙醇產(chǎn)量是基于發(fā)酵過程中酵母所轉(zhuǎn)化的糖的總量（主要是葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖），它和發(fā)酵度、酵母細(xì)胞數(shù)、麥汁營養(yǎng)成分（主要是氮源和碳源）之間都是相互聯(lián)系的，發(fā)酵環(huán)境中豐富的營養(yǎng)成分促進(jìn)酵母細(xì)胞生長，提高發(fā)酵度，高的糖含量和大量的酵母導(dǎo)致高的乙醇產(chǎn)量。酵母對(duì)乙醇的耐受性一定程度上依賴于菌種，啤酒酵母對(duì)乙醇的耐受性較低，通常情況下，乙醇濃度超過10%vol會(huì)嚴(yán)重抑制酵母菌的生長[27]。不同濃度麥汁中酵母的產(chǎn)乙醇量如圖4，隨著麥汁濃度增大，酵母的最終的乙醇產(chǎn)量依次增加，并且有顯著性差異（P＜0.05）。24°P超高濃麥汁中的酵母產(chǎn)乙醇量最大，為11.48%vol；16°P和20°P高濃麥汁中酵母的乙醇產(chǎn)量分別是7%vol和10.59%vol，均高于常濃麥汁（5.32%vol），而低濃麥汁中乙醇產(chǎn)量僅為3.1%vol，這是因?yàn)榈蜐恹溨袪I養(yǎng)物質(zhì)的缺乏影響了酵母的發(fā)酵，而常濃及高濃麥汁中豐富的營養(yǎng)組成滿足了酵母對(duì)糖的降解。

圖4 不同麥汁濃度下的乙醇產(chǎn)量

2.5 不同麥汁濃度對(duì)啤酒風(fēng)味的影響

不同麥汁濃度對(duì)啤酒高級(jí)醇、酯產(chǎn)量的影響見表1。麥汁濃度從8°P升高至24°P，總高級(jí)醇的含量增加，總酯的含量減少。主要的高級(jí)醇有：異戊醇和苯乙醇，隨著麥汁濃度增大異戊醇的含量顯著增加，16 °P、20 °P、24 °P高濃麥汁中的異戊醇含量分別約為常濃麥汁（16 °P）的1.26、1.44、1.86倍，而苯乙醇的含量快速降低，但總高級(jí)醇的含量是呈增加趨勢，這是因?yàn)辂溨笑?氨基氮含量對(duì)啤酒發(fā)酵時(shí)高級(jí)醇生成量有明顯影響，α-氨基氮含量過高或過低都會(huì)使高級(jí)醇生成量增加[28]。說明高濃麥汁中豐富的氮源水平促進(jìn)了啤酒高級(jí)醇的生成。此外，乙酸乙酯產(chǎn)量在24°P超高濃麥汁發(fā)酵中最大，為13.52 mg/L；隨著麥汁濃度的增大，辛酸乙酯、癸酸乙酯含量在減少，丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯在高濃發(fā)酵后麥汁中含量很少，甚至未檢測到，說明高滲透壓環(huán)境改變了酵母細(xì)胞對(duì)酯的代謝[29]。

表1 不同麥汁濃度發(fā)酵下啤酒的風(fēng)味物質(zhì)組成 (mg/L)

啤酒中高級(jí)醇和酯的比例是衡量啤酒感官的一個(gè)重要指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)啤酒的醇酯比一般在4～5∶1的水平[30]。本研究中隨著麥汁濃度增大，醇酯比呈升高趨勢，8 °P、12 °P、16 °P、20 °P、24 °P麥汁發(fā)酵結(jié)束后，高級(jí)醇酯比分別約為0.87∶1、1.62∶1、3.06∶1、4.06∶1、4.07∶1，可見，高濃麥汁發(fā)酵增加了啤酒的柔和性，使啤酒口感更加協(xié)調(diào)，這對(duì)生產(chǎn)是非常有利的。

2.6 不同濃度麥汁發(fā)酵過程中氨基酸的同化

發(fā)酵過程中麥汁游離氨基酸的濃度和種類是酵母細(xì)胞對(duì)其吸收和分泌的綜合結(jié)果。本研究分別在麥汁發(fā)酵開始和結(jié)束時(shí)對(duì)麥汁中的游離氨基酸組成和含量進(jìn)行了測定，通過氨基酸同化量來確定不同麥汁濃度條件下酵母對(duì)氨基酸的吸收規(guī)律和適應(yīng)高濃條件的關(guān)鍵氨基酸，見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥汁濃度從8°P升高到20°P時(shí)，總的游離氨基酸同化量顯著增加（提高了60%），這說明在啤酒高濃釀造中酵母需要更多的額外可同化氮源適應(yīng)環(huán)境脅迫[20]。然而，超高濃24°P的總氨基酸同化量最低，這是因?yàn)楦邼B透壓抑制了酵母的生長，影響了酵母對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。此外，在不同的滲透壓條件下，Asp、Ser、Arg、Met、Lys和Trp的同化量都保持在較高水平，Phe和Trp的同化量隨麥汁濃度的增大逐漸升高，這與不同濃度麥汁改變了酵母對(duì)氨基酸的同化模式有關(guān)系。試驗(yàn)中麥汁濃度的升高增加了發(fā)酵環(huán)境中總的游離氨基酸水平，但是，麥汁中氨基酸含量的升高并不一定能促進(jìn)酵母對(duì)氨基酸的同化，這是氮代謝物阻遏效應(yīng)的結(jié)果[31]。

表2 不同麥汁濃度發(fā)酵下酵母對(duì)游離氨基酸的同化 (mg/L)

2.7 高滲透壓環(huán)境脅迫下關(guān)鍵氨基酸的確定

根據(jù)不同濃度麥汁發(fā)酵過程中氨基酸的同化量與麥汁發(fā)酵度、乙醇產(chǎn)量和酵母活細(xì)胞率的相關(guān)性分析得到（表3）：在不同麥汁濃度條件下Ser、Met、Phe、Trp與酵母活細(xì)胞率呈顯著正相關(guān)性，His與發(fā)酵度呈顯著正相關(guān)，Phe與乙醇產(chǎn)量也呈顯著正相關(guān)，說明這幾種氨基酸對(duì)酵母適應(yīng)高滲透壓環(huán)境脅迫作用有顯著的影響。

表3 游離氨基酸同化量與發(fā)酵性能各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析a

3 結(jié)論

隨著麥汁濃度升高，乙醇產(chǎn)量顯著增加，F(xiàn)AN的消耗升高，酵母生長減緩，發(fā)酵后期活細(xì)胞率降低，高級(jí)醇產(chǎn)量顯著增加，酯產(chǎn)量減少，有效增大了高級(jí)醇酯比，有利于改善啤酒風(fēng)味，使得啤酒口感更加柔和、協(xié)調(diào)。此外，高濃麥汁產(chǎn)生的高滲透壓可導(dǎo)致酵母在生長初期出現(xiàn)短暫的延滯期，但豐富的氮源能很快消除高滲透壓的抑制作用，提高酵母的發(fā)酵性能。在不同麥汁濃度下，酵母對(duì)各氨基酸的同化量不盡相同，并經(jīng)高滲透壓環(huán)境脅迫下酵母對(duì)游離氨基酸的同化量與發(fā)酵結(jié)束時(shí)麥汁的發(fā)酵度、乙醇產(chǎn)量、酵母活細(xì)胞率的相關(guān)性分析得到：Ser、Met、Phe、Trp、His的同化量與發(fā)酵性能呈顯著正相關(guān)性，說明這些氨基酸有助于酵母適應(yīng)高滲透壓的環(huán)境脅迫。

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