劉 健 周麗雅 崔榮麗 金 珠 林三仁 張賀軍 韓亞京 張 穎 尚惠茹 李松茹

(北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科，北京 100191)

針對胃癌(gastric cancer，GC)診斷的新方法，我課題組歷經(jīng)數(shù)十年的探索和研究，建立了基于胃液熒光光譜診斷和篩查胃癌的方法[1]，分離3種芳香族氨基酸(aromatic amino acids，AAAs)熒光標(biāo)志物，即酪氨酸(tyrosine,Tyr)、苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)、色氨酸(tryptophan,Trp)，并分別應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)和核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)的方法進(jìn)行鑒定[2]。應(yīng)用高效液相(high-performance liquid chromatography，HPLC)進(jìn)行定量研究的結(jié)果表明，3種胃液游離AAAs可以用于鑒別早期和進(jìn)展期胃癌與胃良性病變[3]。上述研究成果得到國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可[4,5]，并得到蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域國際權(quán)威期刊Journal of Proteomics[6]和腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域國際權(quán)威期刊Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention[7]的大幅引用。

但胃癌患者胃液AAAs濃度異常升高的機(jī)制尚不明確。既往我課題組對這一現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行一系列探索，如參與細(xì)胞間L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(LAT1)，參與細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝的酶如吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)和單胺氧化酶(MAO)，以及參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解/自噬相關(guān)的蛋白SQSTM1/p62，但都因?yàn)樯鲜龅鞍自诓煌±眍愋臀赴┙M織中的表達(dá)差異較大而無法解釋各型胃癌患者胃液AAAs濃度均異常升高這一現(xiàn)象[8]。本研究旨在探索參與細(xì)胞外代謝的酶及其相關(guān)的蛋白，即基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase-2/9，MMP-2/9)和Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen，Col Ⅳ)蛋白，在胃癌組織中的表達(dá)情況及其與胃癌患者胃液AAAs濃度異常升高之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(IRB00006761-2016058)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①因上腹不適等消化道癥狀就診，行胃鏡及胃黏膜活檢；②年齡≥18歲；③胃液中無食團(tuán)、出血及膽汁反流。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)歷過胃、食管或十二指腸手術(shù)或放化療；②合并其他部位或血液系統(tǒng)惡性腫瘤；③合并外傷及嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾?。虎茉袐D或哺乳婦女。

在患者知情同意下，2015年12月～2016年8月共收集120例患者的胃黏膜組織(胃竇和胃體至少各1塊)和胃液標(biāo)本。腫瘤分級依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版胃癌TNM分期，組織學(xué)形態(tài)分型依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)第4版胃癌分型，異型增生(atypical hyperplasia，ATP)的診斷依據(jù)帕多瓦國際分類標(biāo)準(zhǔn)，慢性胃炎(chronic gastritis，CG)的診斷依據(jù)新悉尼系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)病理診斷結(jié)果分為胃癌(GC)組和胃良性病變(non-neoplastic gastric diseases，NGD)組。GC組29例，年齡31～84歲，(60.2±13.6)歲；男19例，女10例；病理為管狀腺癌17例，低分化腺癌6例，印戒細(xì)胞癌4例，黏液腺癌2例；早期11例(ⅠA期10例，ⅠB期1例)，進(jìn)展期18例(Ⅱ期4例，Ⅲ期10例，Ⅳ期4例)。NGD組91例;年齡29～88歲，(62.4±13.4)歲;男35例，女56例;病理為胃黏膜異型增生46例，胃黏膜萎縮/腸化28例，慢性淺表性胃炎17例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 兔抗人MMP-2多克隆抗體(ZA-0331)、兔抗人MMP-9單克隆抗體(ZA-0562)、小鼠抗人Col Ⅳ單克隆抗體(ZM-0081)、山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-6001)、山羊抗小鼠IgG/HRP聚合物(PV-6002)、胃蛋白酶消化液(ZLI-9013)、檸檬酸組織抗原修復(fù)液(pH 6.0)(ZLI-9065)、磷酸鹽(phosphate buffered saline, PBS)緩沖液(ZLI-9065)、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobezidin，DAB)顯色試劑盒(ZLI-9018)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。甲醇(色譜純)(美國Fisher Scientific公司)，甲酸(色譜純)(美國Dikma公司)，3種AAAs標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)，3種AAAs氘標(biāo)記(英國CIL公司)。組織自動脫水機(jī)、包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、烘片機(jī)均產(chǎn)自德國Leica公司；生物顯微鏡產(chǎn)自日本Nikon公司；數(shù)字病理切片掃描儀產(chǎn)自日本Harmatamo公司。液相色譜儀(LC20-A)產(chǎn)自日本島津公司；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(QTRAP 5500)產(chǎn)自美國Applied Biosystem公司；一次性使用吸痰包產(chǎn)自中國蘇州可邦高分子醫(yī)療器械有限公司。

1.2.2 組織標(biāo)本處理及免疫組織化學(xué)法檢測MMP-2、MMP-9和Col Ⅳ蛋白的表達(dá) 組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。一張常規(guī)HE染色，余做免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision二步法，MMP-2和MMP-9蛋白采用高溫高壓組織抗原修復(fù)法，Col Ⅳ蛋白采用胃酶消化法修復(fù)組織抗原，染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照。

由2位消化病理醫(yī)師應(yīng)用雙盲法獨(dú)立觀察，每張切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野，對陽性染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并評分，取平均值。若2位病理醫(yī)師評分結(jié)果差異較大，則經(jīng)討論達(dá)成共識，或請第3位年資更高的病理醫(yī)師協(xié)助完成。

MMP-2和MMP-9蛋白陽性著色顯示為細(xì)胞胞質(zhì)呈淡黃色至棕褐色著色；Col Ⅳ蛋白陽性著色顯示為胃腺體和脈管周圍基底膜有連續(xù)、環(huán)形淡黃色至棕褐色顆粒沉著。MMP-2和MMP-9蛋白陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)[9]：陽性細(xì)胞比例：無為0分，<10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度：無為0分，弱或淡黃色為1分，強(qiáng)或棕黃色為2分，極強(qiáng)或棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度：0～3分為(-)，4～5分為(+)，6～8分為(++)，>8分為(+++)，(-)和(+)為陰性，(++)和(+++)為陽性。

Col Ⅳ蛋白陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)[10]：根據(jù)腺體周圍基底膜線性染色的完整性分為：(-)基底膜基本缺如：線狀結(jié)構(gòu)<10%，或呈碎片狀表達(dá)，記0分；(+)基底膜大部缺損：線狀結(jié)構(gòu)介于10%～25%，呈細(xì)小的條索狀表達(dá)，記1分；(++)基底膜基本存在：線狀結(jié)構(gòu)介于25%～50%，呈條索狀表達(dá)，記2分；(+++)基底膜大部保留：線狀結(jié)構(gòu)介于50%～75%，呈斷線狀表達(dá)，記3分；(++++)基底膜基本完整：線狀結(jié)構(gòu)>75%，呈連續(xù)、環(huán)形表達(dá)，記4分。(-)和(+)為陰性；(++)、(+++)和(++++)為陽性。

1.2.3 胃液標(biāo)本處理及AAAs濃度檢測 禁食一夜，于胃鏡下通過一次性吸痰管收集5～10 ml胃液。將收集到的胃液置于干冰上短期保存，3000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，分裝入2 ml凍存管，置于-80 ℃長期保存。檢測前將胃液從超低溫冰箱(-80 ℃)中取出，冰浴解凍；加入100%甲醇(1∶10)漩渦振蕩(2 min)離心(15000 r/min，4 ℃，5 min)，沉淀蛋白；取上清，加入純化水(1∶1～1∶5)稀釋。待高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

應(yīng)用梯度洗脫反相液相色譜分離AAAs(流動相的選取，水相為1/1000甲酸，有機(jī)相為純甲醇)，使用電噴霧離子源(ESI+)，多重離子反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)模式檢測AAAs質(zhì)譜信號。使用Phenomenex synergi Polar-RP 80A色譜柱(長度50 mm，內(nèi)徑2.0 mm，填料粒徑4 μm)，流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水溶液，2.0 μl進(jìn)樣。梯度洗脫，液相色譜反應(yīng)條件設(shè)置：在0～2 min期間，流動相A所占的比例從3%逐漸升高到50%；在2～3 min期間，流動相A所占的比例維持在50%；在3.0～3.1 min期間，流動相A所占的比例從50%迅速下降到3%；在3.1～6.5 min期間，流動相A所占的比例維持在3%。流速0.25 ml/min，進(jìn)樣量2 μl，柱溫30 ℃，分析時(shí)長6.5 min。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式檢測(ESI+)；離子噴射電壓3500 V；溫度550 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力50 units；氣體2(GS2，N2)壓力40 units；氣簾氣壓力40 units；掃描方式為MRM模式；碰撞氣(N2)壓力Media；每個(gè)氨基酸化合物的MRM條件見表1。酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的色譜峰對應(yīng)的保留時(shí)間分別為1.0、1.4和2.9 min，質(zhì)譜信號無干擾。

表1 LC-MS/MS檢測芳香族化合物的MRM條件

LC-MS/MS：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；MRM：多重離子反應(yīng)監(jiān)測；酪氨酸-d2：酪氨酸氘標(biāo)記；苯丙氨酸-d5：苯丙氨酸氘標(biāo)記；色氨酸-d8：色氨酸氘標(biāo)記

1.2.4 LC-MS/MS定量檢測胃液中AAAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率和準(zhǔn)確度 使用雙蒸水分別配制8個(gè)濃度(0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)液內(nèi)所含L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸的量均相等，-20 ℃保存，檢測胃液AAAs濃度時(shí)取出用于標(biāo)定建立AAAs定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測化合物信號峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的比值和化合物濃度作圖，得到其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性回歸系數(shù)以及線性區(qū)間分別為：酪氨酸，y(濃度)=1.79x(化合物峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值)+0.0236，r=0.9994，0.1～20.0 μg/ml；苯丙氨酸，y=1.14x+0.0171，r=0.9985，0.1～20.0 μg/ml；色氨酸，y=1.09x+0.0493，r=0.9988，0.1～20.0 μg/ml。加樣回收率分別為：酪氨酸101.6%～101.8%，苯丙氨酸98.5%～107.3%，色氨酸98.2%～111.7%。精密度分別為：酪氨酸2.63%～7.04%，苯丙氨酸1.32%～8.93%，色氨酸，1.90%～11.02%。以上結(jié)果均支持本定量胃液中AAAs的實(shí)驗(yàn)體系可靠穩(wěn)定。若檢測到的游離AAAs濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍，則需要將原樣本重新稀釋后再進(jìn)行檢測。如果樣本中游離AAAs濃度過低，超出檢測下限，則將其視為零。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果

見圖1。GC組中，MMP-9在腫瘤組織中的表達(dá)以間質(zhì)炎細(xì)胞表達(dá)為主，在腫瘤上皮細(xì)胞中僅有3例呈局灶的弱陽性表達(dá)，且這3例間質(zhì)炎細(xì)胞中MMP-9均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。MMP-9蛋白的陽性表達(dá)與炎癥活動關(guān)系密切，24例MMP-9蛋白陽性表達(dá)的腫瘤組織均伴有炎癥活動，其余5例MMP-9蛋白陰性表達(dá)的腫瘤組織均不伴有炎癥活動。NGD組中，MMP-9蛋白在伴有炎癥活動的28例胃良性病變組織中，11例(39.3%)呈陽性表達(dá)，而在不伴有炎癥活動的63例胃良性病變組織中，僅12例(19.0%)呈陽性表達(dá)。

圖1 不同病理類型胃黏膜組織中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白免疫組織化學(xué)染色(×20)，GC為胃癌，ATP為異型增生，CG為慢性胃炎

GC組中MMP-2和MMP-9蛋白在腫瘤上皮細(xì)胞和間質(zhì)炎細(xì)胞中的陽性表達(dá)率[89.7%(26/29)和82.8%(24/29)]顯著高于NGD組[41.1%(37/90)和25.6%(23/90)](χ2=20.746，P=0.000；χ2=30.033，P=0.000)，Col Ⅳ蛋白的陽性表達(dá)率[10.3%(3/29)]顯著低于NGD組[71.4%(65/91)](χ2=33.416，P=0.000)(1例慢性胃炎患者行MMP-2蛋白檢測及1例異型增生患者行MMP-9蛋白檢測時(shí)，胃竇胃體2個(gè)部位均脫片嚴(yán)重，未進(jìn)行評分和統(tǒng)計(jì))。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色評分表示蛋白的表達(dá)水平，GC組MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平[中位數(shù)8(3～12)，9(4～12)]顯著高于NGD組[4(0～8)，4(0～9)](Z=-6.324、-6.588，P均=0.000)，Col Ⅳ蛋白的表達(dá)水平[0(0～3)]顯著低于NGD組[2(0～4)](Z=-6.300，P=0.000)，見圖2A。

2.2 胃液游離AAAs濃度檢測結(jié)果

GC組胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的濃度分別為28.3(1.08～323)，37.9(2.33～362)和10.1(0.424～124)μg/ml，均顯著高于NGD組的3.91(0.155～54.5)，5.30(0.118～93.0)和1.05(0.044～75.5)μg/ml(Z=-5.205、-5.710、-5.631，P=0.000)，見圖2B。

2.3 胃黏膜組織中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表達(dá)水平的關(guān)系

應(yīng)用免疫組化評分表示上述3種蛋白在胃黏膜組織中的表達(dá)水平，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系(ρ=0.418，P=0.000)，二者均與Col Ⅳ蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(ρ=-0.454，P=0.000；ρ=-0.383，P=0.000)，見圖3。

2.4 胃黏膜組織中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表達(dá)水平與胃液AAAs濃度間的關(guān)系

胃黏膜組織中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平均與胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸濃度呈正相關(guān)關(guān)系(MMP-2與酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的相關(guān)系數(shù)分別為ρ=0.262、0.295和0.293，P=0.004、0.001和0.001，MMP-9分別為ρ=0.442、0.437和0.400，P均=0.000)，而Col Ⅳ蛋白的表達(dá)水平與胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸濃度之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(ρ=-0.283、-0.280和-0.273，P=0.002、0.002和0.003)，見圖4。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是在1962年發(fā)現(xiàn)的一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，是由28種MMP構(gòu)成的超家族，各型MMP之間具有一定的特性。許多研究報(bào)道MMP-2/9通過降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的Col Ⅳ蛋白，在胃癌發(fā)生和發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用[11,12]。因此，本研究從細(xì)胞外代謝入手，以Col Ⅳ蛋白為靶點(diǎn)，MMP-2/9為切入點(diǎn)，游離AAAs為代謝產(chǎn)物，以期解釋胃癌患者胃液AAAs濃度異常升高的原因。

本研究結(jié)果表明，胃癌組織中MMP-2蛋白在腫瘤細(xì)胞胞漿和間質(zhì)炎細(xì)胞中的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，尤其是在腫瘤組織的浸潤前緣，陽性表達(dá)率為89.7%，這與既往研究報(bào)道相同[13,14]。但MMP-9蛋白在腫瘤細(xì)胞胞漿中幾乎無表達(dá)或局灶呈弱陽性表達(dá)，卻在腫瘤間質(zhì)的炎細(xì)胞中大量表達(dá)，且表達(dá)水平與腫瘤組織中炎癥的活動程度關(guān)系密切，表達(dá)部位與腫瘤組織中的微血管分布相一致。偶見浸潤到腺上皮細(xì)胞中的炎細(xì)胞表現(xiàn)為MMP-9蛋白陽性表達(dá)。本研究觀察到的MMP-9蛋白表達(dá)模式與Bergin等[15]的報(bào)道一致，即MMP-9蛋白在幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)陽性的上皮固有層間質(zhì)細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，而在幽門螺桿菌陰性的組織細(xì)胞中無表達(dá)；幽門螺桿菌陽性的胃黏膜組織中MMP-9的活性是幽門螺桿菌陰性胃黏膜組織的19倍。此外，本研究觀察到絕大部分MMP-9蛋白于腫瘤間質(zhì)的炎細(xì)胞中和癌巢周圍的壞死滲出灶中大量表達(dá)。這可能與胃癌組織常伴較嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，或胃癌組織壞死后滲出的過程中會引起較嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)有關(guān)。大量炎癥細(xì)胞富集在腫瘤組織周圍，合成并分泌大量的MMP-9蛋白，然后釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中。也有可能是腫瘤細(xì)胞合成MMP-9蛋白后將其分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，被單核巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞吞噬，進(jìn)而表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)，而間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)或高表達(dá)MMP-9蛋白?？傊?，炎癥和腫瘤相互促進(jìn)，形成惡性循環(huán)。腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞通過MMP-9等蛋白進(jìn)行對話，維持或打破原有的分子之間的平衡，形成具有一定特征的腫瘤微環(huán)境。

本研究應(yīng)用LC-MS/MS法檢測，觀察到GC患者胃液中3種游離AAAs的濃度均顯著高于NGD，與我課題組既往應(yīng)用HPLC法檢測的結(jié)果一致[2,3]。但是HPLC法檢測一例至少需要30 min，檢測效率較低，且樣本的前處理方法也比較復(fù)雜，大大限制了其臨床應(yīng)用的可行性。本研究應(yīng)用LC-MS/MS法的優(yōu)勢在于：①前處理的方法相對簡單，不需要衍生，直接沉淀蛋白稀釋后即可進(jìn)樣，顯著縮短分離和分析的時(shí)間，可以達(dá)到高通量檢測的標(biāo)準(zhǔn)；②同位素內(nèi)標(biāo)法靈敏度高，因?yàn)榕c非同位素內(nèi)標(biāo)法相比，該方法更能有效改善基質(zhì)效應(yīng)。因此，LC-MS/MS法可以簡便、快速、準(zhǔn)確、高通量地檢測胃液游離AAAs濃度。

MMP-2/9以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白，參與許多病理過程，如在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用[16]。既往幾項(xiàng)臨床研究表明，MMP-2和MMP-9可以促進(jìn)惡性細(xì)胞的進(jìn)展，可能會促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，因?yàn)槠溆薪到饧?xì)胞外基質(zhì)和基底膜中Col Ⅳ蛋白的能力[17]。本研究結(jié)果表明，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，二者均與Col Ⅳ蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與既往國內(nèi)外研究報(bào)道的結(jié)果一致。類似的是，Ruan等[10]報(bào)道胃癌組組織蛋白酶D(cathepsin D，Cath-D)的陽性表達(dá)率與基底膜中Col Ⅳ的連續(xù)性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.33，P=0.015)?？傊[瘤組織發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移一定伴有基底膜的破壞，這一過程可以通過MMP-2/9、Cath-D和其他蛋白酶來實(shí)現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，胃黏膜組織中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白的表達(dá)水平與胃液3種AAAs濃度之間均存在一定的相關(guān)性(P<0.01)。具體來說，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平與胃液3種AAAs濃度呈正相關(guān)關(guān)系，而Col Ⅳ蛋白的表達(dá)水平與胃液3種AAAs濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述每一種蛋白與胃液3種AAAs間的相關(guān)系數(shù)都基本一致，而3種蛋白中以MMP-9蛋白與胃液AAAs濃度之間的相關(guān)性最高。考慮與MMP-2蛋白相比，除分解Col Ⅳ外，MMP-9蛋白還可能通過促進(jìn)新生血管生成，以

圖2 MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白在胃黏膜組織中表達(dá)水平的散點(diǎn)圖(A)；胃液3種AAAs濃度的散點(diǎn)圖(B)(Tyr為酪氨酸，Phe為苯丙氨酸，Trp為色氨酸，***表示2組間P=0.000) 圖3 MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白在胃黏膜組織中表達(dá)水平的相關(guān)性(ρ為Spearman相關(guān)系數(shù)) 圖4 胃黏膜組織中MMP-2/9和Col Ⅳ蛋白表達(dá)水平與胃液AAAs濃度的相關(guān)性(ρ為Spearman相關(guān)系數(shù)，Tyr為酪氨酸，Phe為苯丙氨酸，Trp為色氨酸)

及增加胃黏膜和毛細(xì)血管的通透性，增加胃液AAAs濃度。也有可能MMP-9蛋白通過促進(jìn)其他蛋白如COX-2等表達(dá)增強(qiáng)，從而發(fā)揮類似作用[18]。

總體來說，胃癌組織通過上調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中Col Ⅳ蛋白，可能是胃癌患者胃液游離AAAs濃度異常升高的原因之一。

1 劉 健，閆秀娥，周麗雅，等.胃液固有熒光光譜在胃癌診斷中的應(yīng)用進(jìn)展.中國微創(chuàng)外科雜志，2018，18(1):64-67.

2 Deng K，Lin S,Zhou L,et al.Three aromatic amino acids in gastric juice as potential biomarkers for gastric malignancies.Anal Chim Acta,2011,694(1-2):100-107.

3 Deng K,Lin S,Zhou L,et al.High levels of aromatic amino acids in gastric juice during the early stages of gastric cancer progression.PLoS One,2012,7(11):e49434.

4 Huang L,Xu A.Detection of digestive malignancies and post-gastrectomy complications via gastrointestinal fluid examination.Front Med,2017,11(1):20-31.

5 Pinheiro Ddo R,Ferreira WA,Barros MB,et al.Perspectives on new biomarkers in gastric cancer: diagnostic and prognostic applications.World J Gastroenterol,2014,20(33):11574-11585.

6 Wu W,Chung MC.The gastric fluid proteome as a potential source of gastric cancer biomarkers.J Proteomics,2013,90:3-13.

7 Wiggins T,Kumar S,Markar SR,et al.Tyrosine,phenylalanine,and tryptophan in gastroesophageal malignancy: a systematic review.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2015,24(1):32-38.

8 Li ZP,Li Y,Liu J,et al.Overexpression of cytoplasmic p62 protein is associated with poor prognosis in gastric adenocarcinoma.Int J Clin Exp Pathol,2016,9(8):8492-8498.

9 Hwang TL,Lee LY,Wang CC,et al.Claudin-4 expression is associated with tumor invasion,MMP-2 and MMP-9 expression in gastric cancer.Exp Ther Med,2010,1(5):789-797.

10 Ruan HL,Hong RT,Xie HJ,et al.Significance of elevated levels of collagen type Ⅳ and hyaluronic acid in gastric juice and serum in gastric cancer and precancerous lesion.Dig Dis Sci,2011,56(7):2001-2008.

11 Wang HL,Zhou PY,Zhang Y,et al.Relationships between abnormal MMP2 expression and prognosis in gastric cancer:a meta-analysis of cohort studies.Cancer Biother Radiopharm,2014,29(4):166-172.

12 Chen J,Chen LJ,Zhou HC,et al.Prognostic value of matrix metalloproteinase-9 in gastric cancer:a meta-analysis.Hepatogastroenterology,2014,61(130):518-524.

13 Bornschein J,Seidel T,Langner C,et al.MMP2 and MMP7 at the invasive front of gastric cancer are not associated with mTOR expression.Diagn Pathol,2015,10:212.

14 Gurgel DC,Valen?a-Junior JT,Dornelas CA,et al.Immunoexpression of metalloproteinases 2 and 14 and TIMP-2 inhibitor in main types of primary gastric carcinomas and lymph node metastasis.Pathol Oncol Res,2015,21(1):73-81.

15 Bergin PJ,Anders E,Sicheng W,et al.Increased production of matrix metalloproteinases in Helicobacter pylori-associated human gastritis.Helicobacter,2004,9(3):201-210.

16 Brown GT,Murray GI.Current mechanistic insights into the roles of matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis.J Pathol,2015,237(3):273-281.

17 Peng CW,Liu XL,Liu X,et al.Co-evolution of cancer microenvironment reveals distinctive patterns of gastric cancer invasion: laboratory evidence and clinical significance.J Transl Med,2010,8:101.

18 Mrena J,Wiksten JP,Nordling S,et al.MMP-2 but not MMP-9 associated with COX-2 and survival in gastric cancer.J Clin Pathol,2006,59(6):618-623.