王 黎 柯 鴻

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

急性淋巴細胞白血病（ALL）是一類起源于淋巴細胞的T系或B系細胞在骨髓內(nèi)異常分化和增生的惡性克隆性疾?。?］。這些異常增生的細胞可聚集于骨髓并抑制造血干細胞的正常造血功能，同時，異常增生的原始細胞也可廣泛浸潤至骨髓外的淋巴結(jié)、肝、脾、肺、腦膜、性腺等組織，如不及時采取有效的治療，約20%的兒童和70%的成人會短期內(nèi)死亡［2］。研究表明，磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號傳導(dǎo)通路參與多種細胞功能，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞分化、細胞周期和細胞凋亡等［3］。同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）為具有磷酸酶活性的抑癌基因，在細胞生長信號通路中起重要作用，在急性淋巴細胞白血病中，PTEN沉默或突變失活會失去對PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的抑制作用，造成去對信號傳導(dǎo)通路活化而引起下游的Akt磷酸化［4］。而持續(xù)活化的Akt通過磷酸化下游廣泛的靶點蛋白，進而促進細胞生長或抑制細胞凋亡，并最終導(dǎo)致白血病細胞大量增生［5］。另有研究表明，淫羊藿苷具有抗腫瘤、促進間充質(zhì)干細胞增殖及遷移等作用［6-7］。但這些實驗結(jié)論大多采用體外細胞培養(yǎng)方面，而針對活體卻鮮有報導(dǎo)，對與急性淋巴細胞白血病發(fā)病極其相關(guān)的去對信號傳導(dǎo)通路方面的研究幾無涉及。有鑒于此，本實驗系統(tǒng)觀察了淫羊藿苷對急性淋巴細胞白血病細胞系L1210細胞去對信號傳導(dǎo)通路的影響，為臨床發(fā)掘治療急性淋巴細胞白血病的新藥提供實驗參考?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級DBA/2近交系小鼠60只，雌雄各半，8～10周齡，體質(zhì)量25.50～27.50 g。動物購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)和實驗均在人民醫(yī)院實驗動物中心 ，動物許可證號：SYXK（鄂）2017-0031。

1.2 藥物及試劑

淫羊藿苷購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清購自賽默飛公司；RPMI-1640細胞培養(yǎng)基購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；B細胞淋巴瘤/白血病-2單克隆抗體（Bcl-2）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、PTEN、Akt檢測試劑盒均購自上海甄準生物科技有限公司。急性淋巴細胞白血病細胞系L1210購自上海爾頓生物科技有限公司。

1.3 L1210細胞培養(yǎng)及調(diào)制

將L1210細胞培養(yǎng)瓶移入超菌臺，加RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底后棄去培養(yǎng)液進行傳代，用PBS液洗2次，向瓶底加2.0 mL胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化，待細胞大部分變圓后吸取胰蛋白酶，加6 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕吹打，使細胞成單個懸浮狀態(tài)，轉(zhuǎn)移到含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素G的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)條件：要求培養(yǎng)箱飽和濕度、37℃并通5%CO2，每2～4天加入30%體積的新鮮培養(yǎng)基。注射前收集對數(shù)生長期L1210細胞，1500 r/min離心5 min，棄去上清，用無血清的DMEM 重懸細胞，再次離心 5 min（1500 r/min），細胞計數(shù)后調(diào)制成1×107個/mL的細胞懸液。

1.4 造模與分組

參照文獻［8］，取近交系DBA/2小鼠60只，將上述調(diào)制好的L1210細胞懸液，按每鼠0.1 mL劑量于右側(cè)腹部皮下注射以建立L1210白血病模型，1周后即可成模。然后將小鼠用數(shù)字表編號后隨機均分為模型對照組、陽性對照組、淫羊藿苷2.5 mL/kg組、淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷10 mL/kg組，每組12只。

1.5 給藥方法

5組小鼠均于皮下注射L1210細胞懸液1周后進行相應(yīng)的干預(yù)性治療。其中淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組分別灌胃給予相應(yīng)劑量的淫羊藿苷（8 mg/mL）治療，模型對照組灌胃0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組按0.2 mL/kg的劑量灌胃PI3K/Akt抑制劑 LY294002（500 μmL/L）作對照。 均每日灌胃治療1次，共治療3周。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 靜脈血血象檢測 斷尾取小鼠靜脈血約0.05 mL，采用人工計數(shù)法檢測白細胞計數(shù)及分類，包括L1210細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、白細胞總數(shù)。

1.6.2 Westem blot檢測Bcl-2及p-Akt蛋白表達取血后處死動物，仔細摘取小鼠肝、脾，剪碎并制成組織勻漿液，采用Westem blot檢測Bcl-2及p-Akt蛋白表達。檢測時取上述標本，用聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉封閉，然后加一抗Bcl-2及p-Akt，4℃孵育，過夜后TBST洗滌3次，加二抗，室溫下?lián)u床孵育60 min，TBST洗滌7 min，滴加ECL發(fā)光液，避光反應(yīng)曝光5 min顯影，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析上述凝膠電泳目標條帶光密度值。

1.6.3 RT-PCR檢測Akt和PTEN基因表達 PCR擴增引物序列用pfimer5軟件設(shè)計，標本總RNA用RNA抽提試劑盒一步法提取，并以β-actin為內(nèi)參，PCR擴增后進行半定量分析。其中Akt上游引物：5′-CAGG AATCCAAATGCAGGGGTA-3′。 下游引物：5′-ATCGGACGAAACATCGGTA-3′。 β-actin 上游引物：5′-CACAAAGGGCATGGAAAGATGTC-3′。 下游引物：5′-AC CTACGGGATGGTAACGCGATC-3′。 擴增長度 260 bp；PTEN 上游引物：5′-ACCCAAATACCCGGTCCTA-3′。下游引物 5′-GCTAAGCCTCATGGACC′GACG-3′：擴增長度 270 bp；β-actin 上游引物：5′-CCAGCCACCGACCAGAAGTGAC-3′，下游引物：5′-AGCCTACCTAA TGGTCCCGCAAGAC-3′。擴增條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；然后94℃變性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，取10 μL PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的基因灰度值/β-actin灰度值之比值表示相應(yīng)基因的OD值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用配對t檢驗。檢驗水準為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾質(zhì)量和皮下瘤質(zhì)量比較

見表1。在治療前，5組小鼠均長有皮下瘤，至治療結(jié)束時，陽性對照組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量與模型對照組比較（P＜0.05）。2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤重與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。3個淫羊藿苷組組間比較無差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量比較（±s）

表1 各組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05。

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2.2 各組小鼠尾靜脈血細胞分類及血象比較

見表2。經(jīng)FCM檢測，陽性對照組小鼠尾靜脈血細胞淋巴細胞、白細胞和L1210細胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細胞升高，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷10 mL/kg組小鼠尾靜脈血細胞淋巴細胞、白細胞和L1210細胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細胞升高，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。且上述指標中，5 mL/kg組與 2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與淫羊藿苷5 mL/kg組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠尾靜脈血細胞分類及血象比較（±s）

表2 各組小鼠尾靜脈血細胞分類及血象比較（±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05；與淫羊藿苷2.5 mL/kg組比較，△P＜0.05；與淫羊藿苷5 mL/kg組比較，▲P＜0.05。 下同。

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2.3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達相對表達量的比較

見表3。模型對照組Bcl-2及p-Akt蛋白高表達。而陽性對照組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組Bcl-2及p-Akt蛋白明顯降低表，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組Bcl-2及p-Akt蛋白呈劑量依賴性，淫羊藿苷5 mL/kg組與2.5mL/kg組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與5 mL/kg組與2.5 mL/kg組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達相對表達量比較（β-actin，±s）

表3 各組小鼠Bcl-2及p-Akt蛋白表達相對表達量比較（β-actin，±s）

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2.4 淫羊藿苷對PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對表達量的比較

見表4。與模型對照組比較，陽性對照組和淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和 10 mL/kg組 Akt mRNA蛋白表達水平顯著降低，PTEN mRNA則高表達 （P＜0.05）。淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白呈劑量依賴性，淫羊藿苷5 mL/kg組與2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；淫羊藿苷10 mL/kg與5 mL/kg組和2.5 mL/kg組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 各組小鼠PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對表達量比較（%，±s）

表4 各組小鼠PTEN mRNA和Akt mRNA蛋白相對表達量比較（%，±s）

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3 討 論

PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在機體生理功能中，作為經(jīng)典信號通路之一，除可介導(dǎo)正常細胞的生長和存活，在淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病等細胞增殖及凋亡方面起關(guān)鍵作用［9］。研究表明，被激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路會促使下游Akt磷酸化（p-Akt），而p-Akt通過誘導(dǎo)磷酸化凋亡調(diào)節(jié)蛋白和抗凋亡蛋白表達并間接產(chǎn)生抗細胞凋亡作用［10］。因此，尋找抑制PI3K/Akt信號通路的中藥有一定的研究意義。

在本研究中，2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組小鼠肝、脾組織Bcl-2、p-Akt蛋白和AKT mRNA蛋白表達水平顯著降低，PTEN蛋白和PTEN mRNA則高表達，且這種作用呈劑量依賴性。Akt主要分布于細胞內(nèi)核、線粒體、微粒體和胞液中，在細胞存活和凋亡中起重要作用，因該激酶被證明是反轉(zhuǎn)錄病毒基因v-Akt的編碼產(chǎn)物，故又稱 Akt［11］。PTEN 為新發(fā)現(xiàn)的重要的抑癌基因，PTEN為脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的活化酶，具有拮抗酪氨酸激酶的作用，在Akt磷酸化的過程中發(fā)揮抑制作用，從而產(chǎn)生抑制腫瘤生長和侵襲效應(yīng)［12］。 另外，在 PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路中，PI3K 可通過激活A(yù)kt來調(diào)節(jié)細胞生長周期及細胞遷移、代謝，而PTEN基因低表達能激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路，造成細胞凋亡衰減現(xiàn)象［13］。臨床檢測表明，兒童AmL的骨髓標本中PTEN蛋白表達缺失，從本實驗結(jié)果來看，淫羊藿苷吸收后可調(diào)節(jié)PTEN的活性，提高其蛋白表達，高表達的PTEN可通過拮抗酪氨酸激酶而降低Akt磷酸化，從而發(fā)揮抑制腫瘤的生長和侵襲作用［14］。Bcl-2為白血病凋亡相關(guān)基因，受PTEN調(diào)控，在腫瘤細胞凋亡相關(guān)傳導(dǎo)通路中，主要通過高表達的PTEN下調(diào)Bcl-2基因表達來實現(xiàn)［15］。在本實驗中，小鼠肝、脾組織Bcl-2表達下調(diào)可能是通過PTEN下調(diào)Bcl-2基因表達來實現(xiàn)腫瘤細胞凋亡作用，而淫羊藿苷明顯提高PTEN蛋白及其基因表達，證實淫羊藿苷是通過影響PI3K/Akt信號通路來實現(xiàn)對急性淋巴細胞白血病細胞系L1210細胞增殖的抑制作用。

另外，與模型對照組比較，2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組尾靜脈血細胞淋巴細胞、白細胞和L1210細胞總數(shù)均明顯降低，而中性粒細胞升高，至治療結(jié)束時3中藥組小鼠存活數(shù)、體質(zhì)量、肝脾和皮下瘤質(zhì)量與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。這一結(jié)果證實淫羊藿苷具有肯定的抗急性淋巴細胞白血病細胞系L1210細胞作用。同時，為證實淫羊藿苷對PI3K/Akt信號通路的抑制作用，本實驗還用PI3K/Akt抑制劑LY294002作為陽性對照組。LY294002為PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路抑制劑，可通過阻斷PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路來實現(xiàn)抑制多種腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［16-17］。在本實驗中，陽性對照組對 PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生明顯的抑制作用，而淫羊藿苷2.5 mL/kg組、5 mL/kg組和10 mL/kg組均產(chǎn)生與陽性對照組相同的作用，這種作用雖然沒有LY294002的作用強，但在本觀察中，這一作用所檢測到所有相關(guān)指標均與模型對照組有統(tǒng)計學(xué)差異，這進一步證實淫羊藿苷也具有抑制PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的藥理作用，且在實驗中這種作用呈劑量依賴性。

綜上所述，淫羊藿苷呈劑量依賴性地阻斷PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路而實現(xiàn)抑制L1210細胞增殖效應(yīng)，這一結(jié)果為后期開發(fā)治療急性淋巴細胞白血病的新藥提供了一定的活體實驗依據(jù)。

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