馬 躍，王 越，趙治權(quán)，熊厚鋒

(1.吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012； 2.東北師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.九江學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江西 九江 332005)

目前，抗生素濫用導(dǎo)致的抗性基因傳播、生態(tài)系統(tǒng)失衡已引起了人們的關(guān)注[1-3].其中，四環(huán)素類(lèi)抗生素是應(yīng)用最為廣泛的控制疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的典型抗生素之一，[4]因此四環(huán)素類(lèi)廢水的處理就成為了一個(gè)亟待解決的問(wèn)題.目前被廣泛采用的高級(jí)氧化技術(shù)存在處理費(fèi)用高、礦化不完全的問(wèn)題.此外，由于抗生素具有殺菌、抑菌的特性，生物法不能單獨(dú)完成抗生素廢水的處理，因此工程上廣泛采用高級(jí)氧化法和生物降解聯(lián)合工藝進(jìn)行抗生素廢水的處理，其中抗生素的氧化程度是該工藝高效、低耗的關(guān)鍵調(diào)控因子.光催化氧化-生物降解直接耦合技術(shù)(ICPB)與上述傳統(tǒng)工藝相比，對(duì)抗生素廢水處理具有潛在優(yōu)勢(shì).ICPB體系中，可生物降解的光催化中間產(chǎn)物能夠被微生物直接利用，避免了過(guò)度氧化并提高了礦化效率[5].

ICPB體系已經(jīng)成功應(yīng)用于苯酚[6]、三氯苯酚[7-9]、二硝基甲苯[10]和染料[11]的降解，顯示了ICPB對(duì)難生物降解有機(jī)污染物的處理優(yōu)勢(shì)，后續(xù)又在ICPB的基礎(chǔ)上引入了可見(jiàn)光技術(shù)，建立了可見(jiàn)光誘導(dǎo)的光催化-生物降解直接耦合體系(VPCB)，彌補(bǔ)了以往只能使用紫外光的不足[12].在應(yīng)用VPCB時(shí)，載體內(nèi)部生物膜對(duì)光催化產(chǎn)生中間產(chǎn)物的降解對(duì)提高處理效果起到了至關(guān)重要的作用.尤其是在處理抗生素類(lèi)對(duì)生物抑制性較大的污染物時(shí)，如何保持生物的活性并維持其正常代謝功能是VPCB的難點(diǎn)和關(guān)鍵.解決該問(wèn)題的一個(gè)可能的策略是提供易生物降解的底物(如醋酸鈉)，提供額外的代謝電子加速氧化反應(yīng)并通過(guò)提供碳源促進(jìn)微生物的代謝活性[13]從而優(yōu)化生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)污染物的降解和化學(xué)需氧量(COD)的去除.

本研究通過(guò)對(duì)比VPCB反應(yīng)器中有無(wú)醋酸鈉電子供體時(shí)鹽酸四環(huán)素(TCH)的降解情況、生物膜的存活及光催化中間產(chǎn)物的利用情況，考察了外加電子供體對(duì)VPCB降解TCH的影響，以為抗生素類(lèi)廢水的高效降解提供新的思路.

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 藥品與試劑

鹽酸四環(huán)素(TCH，98%，Sigma-Aldrich Co.Ltd，USA)；醋酸鈉(98%，北京化工廠).TCH模擬廢水的成分包括TCH(30 mg/L，VPCB-1)或TCH(30 mg/L)和外加電子供體醋酸鈉(255 mg/L，VPCB-2).NH4Cl和Na2HPO4·12H2O(98%，北京化工廠)分別作為氮源和磷源，添加量按m(COD)∶m(N)∶m(P)=100∶5∶1來(lái)計(jì)算.

1.2 催化劑的制備與負(fù)載

將2 mmol AgNO3與500 mL 4.0 mmol/L的檸檬酸鈉溶液在密封的頂空瓶中混合并連續(xù)攪拌，溫度逐漸升高到80℃，直至溶液由無(wú)色變?yōu)樽睾谏?；逐滴滴? mol鈦酸異丙酯和0.15 mol HNO3的混合液，不斷攪拌；滴加完成后在50℃的水浴鍋中持續(xù)攪拌24 h，所得溶液放入高壓反應(yīng)釜中130℃水熱5 h，得到Ag/TiO2溶膠[14].將制備的Ag/TiO2溶膠負(fù)載于尺寸為2 mm×2 mm×2 mm、孔徑100～300 μm、孔隙率87%的聚氨酯海綿載體(江蘇哈宜戴沃思生物技術(shù)有限公司)上.

1.3 接種與生物膜培養(yǎng)

將載體浸入活性污泥(取自長(zhǎng)春市南郊污水處理廠)中24 h以吸附微生物，之后將生物膜在內(nèi)循環(huán)流化床中曝氣培養(yǎng)，以醋酸鈉作為碳源.

1.4 反應(yīng)裝置

反應(yīng)裝置為540 mL的有機(jī)玻璃光催化內(nèi)循環(huán)生物反應(yīng)器(見(jiàn)圖1)，由內(nèi)外兩個(gè)空心圓柱環(huán)型構(gòu)成.通過(guò)35 W曝氣泵(濰坊SOBO)向反應(yīng)器的內(nèi)部回路供應(yīng)空氣，流速為10.6 mL/s.實(shí)驗(yàn)所用的可見(jiàn)光光源為L(zhǎng)ED面板燈(42 W，廣東Hueler).

圖1 光催化-生物降解直接耦合(VPCB)反應(yīng)器示意圖

1.5 分析項(xiàng)目與方法

TCH濃度的測(cè)定采用超高效液相色譜(UPLC，美國(guó)Waters)，色譜柱為2.1 mm×50 mm×1.7 μm的BEH C18 色譜柱 (美國(guó)Waters)，以乙腈(10%)和0.1%的甲酸(90%)為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為357 nm.

生物膜上的活、死菌細(xì)胞分布通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察分析得到.采用染色細(xì)菌細(xì)胞活性測(cè)定試劑盒(L-7012，LIVE/DEAD?BacLight TM，Molecular Probes公司，美國(guó))對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色.

利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察載體表面和內(nèi)部催化劑、生物膜結(jié)構(gòu)及其分布情況.首先配置0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖鹽(phosphate buffer solution，PBS，pH=7.2)和2.5%的戊二醛固定液.從反應(yīng)器中取出海綿載體，用PBS溶液清洗后用戊二醛固定液固定；使用冷凍切片包埋劑(Tissue-Tek O.C.T，SAKURA，美國(guó))包埋后進(jìn)行冷凍切片，切片后的樣品用載玻片(覆蓋多聚賴(lài)氨酸)收集；接著用PBS溶液漂洗，并依次使用鋨酸(1%)和多聚甲醛(4%)固定，固定好后用PBS漂洗；然后用5個(gè)梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，最后用無(wú)水乙醇脫水.脫水后的樣品用丙酮置換后可以進(jìn)行噴金鍍膜處理.

不同反應(yīng)條件下載體生物膜中生物群落結(jié)構(gòu)的變化采用高通量宏基因組分類(lèi)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行檢測(cè).

2 結(jié)果和討論

2.1 直接耦合體系的構(gòu)建

通過(guò)載體內(nèi)部和外部電鏡掃描圖片證實(shí)了VPCB體系的成功構(gòu)建.掛膜培養(yǎng)后，載體內(nèi)部和外表面都覆蓋了厚厚的生物膜(初始)，在VPCB中反應(yīng)8 h后，載體外表面的生物膜大部分脫落(VPCB-1，表面)，催化劑暴露出來(lái)，而載體內(nèi)部的生物膜保存下來(lái)(VPCB-1，內(nèi)部)，形成了理想的直接耦合復(fù)合載體.添加外加電子供體醋酸鈉后，載體外表面的生物膜脫落(VPCB-2，表面)，而載體內(nèi)部(VPCB-2，內(nèi)部)的生物膜比VPCB-1(無(wú)醋酸鈉)中的生物膜更加致密、飽滿(mǎn)，表明加入醋酸鈉可以提高微生物的活性(見(jiàn)圖2).

圖2 有無(wú)外加醋酸鈉時(shí)海綿載體內(nèi)部和外表面SEM圖像

2.2 VPCB對(duì)TCH的降解

圖3A為6個(gè)運(yùn)行周期內(nèi)VPCB-2對(duì)TCH的降解情況.添加醋酸鈉后，在6個(gè)周期內(nèi)VPCB-2對(duì)TCH的去除效率穩(wěn)定在80%左右.為了確定醋酸鈉在TCH降解中的作用，將VPCB-2與VPCB-1在一個(gè)典型的周期中進(jìn)行TCH降解的準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合情況進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3B.其中，AD-2和AD-1分別為有、無(wú)電子供體時(shí)海綿載體對(duì)TCH的吸附作用.吸附體系在第1小時(shí)(約15%去除率)內(nèi)快速吸附，隨后是持續(xù)至第12小時(shí)的緩慢狀態(tài)，AD-1和AD-2對(duì)TCH的去吸附率僅為31.1%和21.3%.而直接耦合顯著提高了TCH的去除率，VCPB-1和VCPB-2在1 h時(shí)分別降解了36.2%和61.3%，在12 h時(shí)分別達(dá)到79.4%和86.1%.VPCB-1和VPCB-2對(duì)TCH的降解率常數(shù)(k)分別為0.10和0.14，表明加入醋酸鈉后，TCH的降解速度提高了40%，TCH的去除效率提高了8%.

圖3 外加醋酸鈉運(yùn)行6個(gè)周期TCH降解圖及穩(wěn)定周期降解動(dòng)力學(xué)擬合圖

2.3 微生物活性

圖4為有無(wú)外加醋酸鈉時(shí)海綿載體上生物膜活、死菌染色的激光共聚焦顯微鏡圖.在沒(méi)有外加碳源的情況下，VPCB-1中的生物膜生物活性較低，載體中活菌(綠色)的比例從未開(kāi)始反應(yīng)前的90%下降到57%，這與TCH對(duì)生物的毒害作用有關(guān)；而添加醋酸鈉之后，VPCB-2中載體上的生物膜活性較好，到第8小時(shí)，活菌和死菌(紅色)的比例為86%和14%，基本維持在掛膜后未反應(yīng)前的水平.作為最簡(jiǎn)單的碳源，醋酸鈉很容易被生物利用，促進(jìn)生物的生長(zhǎng)[15]，同時(shí)它也能作為微生物生長(zhǎng)的能源[16-17].當(dāng)環(huán)境中存在不利因素如TCH時(shí)，醋酸鈉的存在能夠促進(jìn)生物膜對(duì)TCH的“抵抗能力”.

圖4 有無(wú)外加醋酸鈉時(shí)海綿載體上生物膜活死菌染色圖

2.4 光催化中間產(chǎn)物的利用

圖5為不同TCH溶液在VPCB-1和VPCB-2中的HPLC-MS總離子流圖及對(duì)應(yīng)的中間產(chǎn)物.可以發(fā)現(xiàn)，VPCB-2比VPCB-1積累了更少的中間產(chǎn)物.在反應(yīng)的前4 h，從VPCB-1和VPCB-2中鑒定出了7個(gè)中間體，除了TCH(m/Z=445)，還有m/Z為477，305，329，287，225，171，444和169的物質(zhì).m/Z為477和444的中間產(chǎn)物是非常常見(jiàn)的光催化產(chǎn)物，通過(guò)TCH的羥基化、·OH反應(yīng)及在C2—C3雙鍵上失去NH3產(chǎn)生.在所有的中間產(chǎn)物中，這兩個(gè)產(chǎn)物有4個(gè)芳香環(huán)，是最不容易生物降解的物質(zhì)，在第4小時(shí)，這兩種物質(zhì)在VPCB-2的強(qiáng)度比VPCB-1低得多，且最后在VPCB-2中消失.此外，除了TCH，在12 h運(yùn)行后VPCB-2的總離子色譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)其他峰.由此我們推測(cè)，出水中幾乎沒(méi)有芳香族化合物殘留，表明VPCB-2對(duì)光催化中間產(chǎn)物具有高效的生物降解能力.而VPCB-1中第4小時(shí)出現(xiàn)的所有產(chǎn)物在第12小時(shí)仍被檢測(cè)到，表明VPCB-1中的微生物利用這些產(chǎn)物的能力較低.結(jié)果說(shuō)明VPCB-2中的微生物降解TCH光催化中間產(chǎn)物的能力有所提高.

圖5 有無(wú)外加醋酸鈉的總離子流圖和中間產(chǎn)物

2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)

從生物多樣性和生物群落結(jié)構(gòu)分布(見(jiàn)圖6)可以看出，以活性污泥為接種種源進(jìn)行培養(yǎng)后(圖中初始樣品)，載體上生物膜群落中的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為Pseudomonas(14.4%)，Zoogloea(25.3%)，Hydrogenophaga(9.7%)，Comamonadaceae(6.6%)和Aeromonas(4.8%).這幾種都是典型的活性污泥所包含的菌屬.其中，Pseudomonas(假單胞菌屬)是活性污泥的主要菌屬之一，Zoogloea屬是一種在活性污泥中可以形成胞外聚合物的菌屬.

對(duì)比后可發(fā)現(xiàn)，在ICPB中添加電子供體醋酸鈉后，載體具有更高的生物量和更好的生物活性，而且與降解芳香環(huán)及其衍生物類(lèi)中間產(chǎn)物相關(guān)的菌屬Comamonas和Pseudomonas也有一定程度的富集；同時(shí)從表征生物多樣性的ACE指數(shù)也可以看出，VPCB-2比VPCB-1具有更好的生物多樣性，這表明添加醋酸鈉后生物膜能更好地適應(yīng)含TCH的廢水.在ICPB中生物膜可以適應(yīng)TCH廢水，以中間產(chǎn)物為碳源和能源保持活性和功能性，生物多樣性的提高與TCH及中間產(chǎn)物的刺激有關(guān).

樣品名序列數(shù)/個(gè)OTU 數(shù)/個(gè)ACE 指數(shù)初始68 7462 1984 998VPCB-1-4h87 6631 9725 174VPCB-2-4h97 6142 1936 074VPCB-1-12h89 9261 8545 631VPCB-2-12h104 5771 9586 102

圖6VPCB-1和VPCB-2運(yùn)行過(guò)程中載體上生物膜的種屬相對(duì)豐度分布圖

本文在VPCB反應(yīng)器中外加醋酸鈉作為電子供體，通過(guò)與沒(méi)有添加醋酸鈉的VPCB反應(yīng)器進(jìn)行對(duì)比后，證明了外加電子供體可以通過(guò)提高載體內(nèi)部微生物的活性加快TCH的降解，光催化中間產(chǎn)物也可被更有效的利用.

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] ZHANG Y，BOYD S A，TEPPEN B J，et al.Organic acids enhance bioavailability of tetracycline in water toEscherichiacoli，for uptake and expression of antibiotic resistance[J].Water Research，2014，65：98-106.

[2] 詹杰，魏樹(shù)和.四環(huán)素在土壤和水環(huán)境中的分布及其生態(tài)毒性與降解[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2015，35(9)：2819-2825.

[3] 張俊，楊曉洪，葛峰，等.長(zhǎng)期施用四環(huán)素殘留豬糞對(duì)土壤中耐藥菌及抗性基因形成的影響[J].環(huán)境科學(xué)，2014，35(6)：2374-2380.

[4] WANG P，YAP P S，LIM T T.C-N-S tridoped TiO2，for photocatalytic degradation of tetracycline under visible-light irradiation[J].Applied Catalysis A General，2011，399(1/2)：252-261.

[5] LI G，PARK S，RITTMANN B E.Developing an efficient TiO2-coated biofilm carrier for intimate coupling of photocatalysis and biodegradation[J].Water Research，2012，46(19)：6489-6496.

[6] MA D，ZOU D，ZHOU D，et al.Phenol removal and biofilm response in coupling of visible-light-driven photocatalysis and biodegradation：effect of hydrothermal treatment temperature[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2015，104：178-185.

[7] LI G，PARK S，KANG D W，et al.2，4，5-trichlorophenol degradation using a novel TiO2-coated biofilm carrier：roles of adsorption，photocatalysis，and biodegradation[J].Environmental Science & Technology，2011，45(19)：8359-67.

[8] ZHANG Y，PU X，F(xiàn)ANG M，et al.2，4，6-trichlorophenol (TCP) photobiodegradation and its effect on community structure[J].Biodegradation，2012，23(4)：575-583.

[9] MARSOLEK M D，KIRISITS M J，GRAY K A，et al.Coupled photocatalytic-biodegradation of 2，4，5-trichlorophenol：effects of photolytic and photocatalytic effluent composition on bioreactor process performance，community diversity，and resistance and resilience to perturbation[J].Water Research，2014，50：59-69.

[10] WEN D，LI G，XING R，et al.2，4-DNT removal in intimately coupled photobiocatalysis：the roles of adsorption，photolysis，photocatalysis，and biotransformation[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2012，95(1)：263-272.

[11] LI G，PARK S，RITTMANN B E.Degradation of reactive dyes in a photocatalytic circulating-bed biofilm reactor[J].Biotechnology & Bioengineering，2012，109(4)：884.

[12] ZHOU D，XU Z，DONG S，et al.Intimate coupling of photocatalysis and biodegradation for degrading phenol using different light types：visible light vs UV light[J].Environmental Science & Technology，2015，49：7776-7783.

[13] MARSOLEK M D，RITTMANN B E.Effect of substrate characteristics on microbial community structure，function，resistance，and resilience；application to coupled photocatalytic-biological treatment[J].Water Research，2015，90：1.

[14] MAN S L，HONG S S，MOHSENI M.Synthesis of photocatalytic nanosized TiO2-Ag particles with sol-gel method using reduction agent[J].Journal of Molecular Catalysis A Chemical，2005，242(1)：135-140.

[15] LIU H，STEPHEN GROT A，B E L.Electrochemically assisted microbial production of hydrogen from acetate[J].Environmental Science & Technology，2005，39(11)：4317.

[16] ALVAREZ-COHEN L，JR S G.Kinetics of aerobic cometabolism of chlorinated solvents[J].Biodegradation，2001，12(2)：105-126.

[17] WAHMAN D G，HENRY A E，KATZ L E，et al.Cometabolism of trihalomethanes by mixed culture nitrifiers[J].Water Research，2006，40(18)：3349.