，， ，， (.陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍衛(wèi)勤訓(xùn)練基地戰(zhàn)救技能訓(xùn)練教研室，重慶 400038；.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶 40004)

抑鈣劑(calcilytics)是特異性的細(xì)胞外鈣敏感受體(calcium sensing receptor，CaSR)的別構(gòu)抑制劑[1]。CaSR最早發(fā)現(xiàn)于牛的甲狀旁腺細(xì)胞[2]，它在鈣代謝相關(guān)的組織器官中高表達(dá)，如甲狀旁腺、腎臟、小腸和骨組織，CaSR在維持體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中有重要作用。CaSR的別構(gòu)激動劑也稱為擬鈣劑(calcimimetics)，已被歐美國家批準(zhǔn)用于臨床治療繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)；相對應(yīng)的抑制劑也即是抑鈣劑，目前用于骨質(zhì)疏松癥的治療研究中[3-5]。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)CaSR在心血管系統(tǒng)、腦和神經(jīng)系統(tǒng)等的器官組織中也有豐富表達(dá)和重要功能[6-8]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，CaSR在血管收縮反應(yīng)性調(diào)節(jié)中有著重要作用[9]。但其在休克后心血管功能障礙時的作用如何，目前尚不清楚。本研究通過觀察抑鈣劑NPS 2143對創(chuàng)傷失血性休克大鼠的存活情況、血壓變化及血流動力學(xué)指標(biāo)的影響，初步探討CaSR在休克后血管功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

128只清潔級SD大鼠，體質(zhì)量180～230 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。抑鈣劑NPS 2143(Tocris Bioscience，Bristol，UK；Cat.No.3626，Batch No.1B/160801)。

1.2 休克模型制備及實驗分組

采用本實驗室常規(guī)方法制備大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型[10]：動物麻醉后，行右側(cè)股骨骨折，通過左側(cè)股動脈插管放血使血壓下降至30 mmHg，并維持在此水平2 h，即為休克模型成功。隨后通過左側(cè)股靜脈插管來復(fù)蘇給藥。96只大鼠用于存活實驗，隨機(jī)分為6組(n=16)：正常組、休克組、乳酸林格氏液(LR)組、LR+NPS 2143 0.1 mg/kg組、LR+NPS 2143 1 mg/kg組、LR+NPS 2143 5 mg/kg組。32只大鼠用于觀察血壓及血流動力學(xué)指標(biāo)，分為4組(n=8)：正常組、休克組、LR組、LR+NPS 2143 1 mg/kg組。

1.3 觀察24 h存活情況

在休克復(fù)蘇結(jié)束后，拔出動靜脈插管、結(jié)扎止血并縫合傷口，肌肉注射抗生素以預(yù)防感染，給予正常飲食，記錄每只大鼠的死亡時間，直至復(fù)蘇后24 h，計算24 h存活率。

1.4 檢測血壓及升壓反應(yīng)、血流動力學(xué)指標(biāo)

在休克前、休克末、復(fù)蘇1 h和復(fù)蘇2 h時相點連續(xù)檢測各項指標(biāo)。通過股動脈插管連接水銀血壓計，記錄平均動脈血壓(MAP)，通過股靜脈插管推注去甲腎上腺素(NE，3 μg/kg)，觀察NE誘導(dǎo)的血壓升高情況[10]。通過頸動脈插管至左心室、連接壓力傳感器和生理記錄儀，記錄各時相點的血流動力學(xué)指標(biāo)：左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)、左心室壓力最大上升/下降速率(maximal change rate of left intraventricular pressure，±dp/dtmax)[11]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NPS 2143對THS大鼠存活的影響

創(chuàng)傷失血性休克是一種致死的損傷因素，不進(jìn)行治療的休克大鼠平均存活時間僅為3 h左右，且存活均不超過10 h。給予LR復(fù)蘇能一定程度上提高休克大鼠的存活時間，存活至24 h的大鼠數(shù)量為4只(總數(shù)16只)。NPS 2143 0.1 mg/kg輸注后大鼠的存活情況與LR組相比無明顯差異，而NPS 2143 1 mg/kg和5 mg/kg 可明顯延長休克大鼠的存活時間，24 h存活大鼠分別為11只和9只，與LR組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05～0.01)，見圖1a、b。

a:NPS 2143對THS大鼠24 h存活只數(shù)的影響；b: NPS 2143對THS大鼠24 h存活時間的影響 *：與正常組比較，P<0.01；#：與LR組比較，P<0.05；△：與LR組比較，P<0.01

圖1NPS2143對THS大鼠24h存活數(shù)量和存活時間的影響(n=16)

2.2 NPS 2143對THS大鼠血壓和升壓反應(yīng)的影響

正常大鼠血壓在整個實驗過程中無明顯變化。休克模型大鼠血壓被維持在30 mmHg，模型完成后休克大鼠血壓隨時間延長進(jìn)一步降低。LR復(fù)蘇后休克大鼠的血壓有所上升。NPS 2143 1 mg/kg輸注可使休克大鼠的血壓進(jìn)一步升高，在復(fù)蘇2 h時明顯高于LR組(P<0.01)。NE誘導(dǎo)的升壓反應(yīng)也顯示了相似的變化趨勢。休克后NE誘導(dǎo)的血壓升幅顯著降低，LR復(fù)蘇有輕度的升高作用，NPS 2143輸注對NE的升壓效應(yīng)有明顯的改善作用(圖2a、b)。

2.3 NPS 2143對THS大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響

休克顯著降低了大鼠的各項血流動力學(xué)指標(biāo)。LR復(fù)蘇對各項指標(biāo)有一定程度的改善作用。1 mg/kg的NPS 2143輸注可明顯升高休克大鼠的LVSP和±dp/dtmax，在復(fù)蘇2 h時明顯高于LR組(P<0.05)。NPS 2143也使HR有所升高，但與LR組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3a～d)。

a:NPS 2143對THS大鼠血壓的影響；b:NPS 2143對THS大鼠血壓升幅的影響； *：與正常組比較，P<0.01；△：與LR組比較，P<0.01

圖2NPS2143對THS大鼠血壓和血壓升幅的影響(n=8)

a：LVSP(左心室收縮壓)；b：HR(心率)；c：+dp/dtmax(左心室壓力最大上升速率)；d：-dp/dtmax(左心室壓力最大下降速率) *：與正常組比較，P<0.01；#：與LR組比較，P<0.05

圖3NPS2143對THS大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響(n=8)

3 討論

CaSR除了參與鈣代謝相關(guān)疾病之外，還參與了腎臟疾病、腫瘤、心血管疾病和阿爾茨海默病等多種疾病的病理過程，因此CaSR調(diào)節(jié)劑在多種疾病治療中的潛力得到了廣泛關(guān)注。NPS 2143是第一個被報道的具有口服生物活性的小分子CaSR別構(gòu)抑制劑(Calcilytics)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為N-[(R)-2-hydroxy-3-(2-cyano-3-chlorophenoxy)propyl]-1,1-dimethyl-2-(2-naphthyl)ethylamine[1,12]。NPS 2143能夠抑制甲狀旁腺中的CaSR活性，促進(jìn)內(nèi)源性甲狀旁腺激素(PTH)分泌，其早期相關(guān)研究的主要目的是開發(fā)治療骨質(zhì)疏松的口服藥物，且目前仍有待進(jìn)一步的臨床驗證[13]。CaSR活化突變可引起常染色體相關(guān)的低鈣血癥(ADH)和Bartter綜合癥(BS5)，這是一類罕見且在臨床上缺乏有效治療措施的疾病，抑鈣劑可特異性抑制CaSR活性并糾正受體突變帶來的一系列病理改變，動物實驗顯示NPS 2143對3種模擬人ADH疾病的模型小鼠都有治療作用，一項小樣本臨床試驗觀察了另一種抑鈣劑NPSP795對5名ADH患者的療效，結(jié)果提示抑鈣劑有可能是ADH和BS5極具潛力的一種治療手段[14]。

隨著心血管系統(tǒng)中存在CaSR被證實，擬鈣劑和抑鈣劑對心血管功能的影響也逐漸被發(fā)現(xiàn)[7,15]。Rybczynska等[16]發(fā)現(xiàn)，靜脈推注NPS 2143可引起血壓正常的Wistar大鼠血壓升高，而對切除甲狀旁腺的大鼠血壓無明顯影響，作者推測NPS 2143升高血壓的作用可能與甲狀旁腺分泌的高血壓因子(parathyroid hypertensive factor，PHF)有關(guān)。另一項研究顯示，阻斷鈣通道和血管緊張素1型受體(AT1)能抑制NPS 2143升高血壓的作用，提示NPS 2143的作用機(jī)制可能不局限于調(diào)節(jié)激素分泌[17]。此外，在關(guān)于肺血管平滑肌細(xì)胞的研究中，Yamamura[18]發(fā)現(xiàn)CaSR參與了肺動脈高壓的病理過程，而NPS 2143可阻止肺動脈高壓和右心室肥大的發(fā)展。但是，與此同時也有一些相關(guān)研究，其結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)NPS 2143對血壓的調(diào)節(jié)作用。

前期大量的實驗工作顯示，復(fù)蘇2 h后的治療效果比較明顯。復(fù)蘇后2 h各項指標(biāo)恢復(fù)較好的大鼠絕大多數(shù)能存活至24～72 h，而復(fù)蘇后2 h各項指標(biāo)較差的大鼠基本上不能存活至24 h，復(fù)蘇后2 h的大鼠狀態(tài)能夠較好地反映該治療方法是否有效，因此我們設(shè)置復(fù)蘇后2 h作為重要的檢測時相點。本實驗結(jié)果提示，抑鈣劑NPS 2143在低劑量(0.1 mg/kg)時對創(chuàng)傷失血性休克大鼠存活情況的影響與單純給予LR復(fù)蘇的效果相似，而中、高劑量的NPS 2143(1和5 mg/kg)都有較明顯的延長休克動物存活時間和提高24 h存活只數(shù)的作用，其治療效果顯著優(yōu)于單純LR復(fù)蘇，在兩者之中，1 mg/kg劑量組略優(yōu)于5 mg/kg劑量組。進(jìn)一步的實驗顯示，NPS 2143(1 mg/kg)能夠升高休克大鼠的血壓，增加NE誘導(dǎo)的升壓反應(yīng)，改善休克后血流動力學(xué)指標(biāo)(包括LVSP和±dp/dtmax)，其作用明顯優(yōu)于LR組。

前期對離體血管的研究結(jié)果顯示，擬鈣劑cinacalcet能誘導(dǎo)內(nèi)皮完整的預(yù)收縮的血管產(chǎn)生舒張，提示CaSR在血管舒縮調(diào)節(jié)中發(fā)揮著一定作用[9]。結(jié)合本實驗結(jié)果，可以推測CaSR在休克后血管功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用，CaSR抑制劑NPS 2143有較好的休克治療作用。抑鈣劑發(fā)揮作用的機(jī)制可能是通過抑制CaSR，改善休克導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞鈣超載，進(jìn)而發(fā)揮血管細(xì)胞保護(hù)作用，但劑量過高時可能引起過度抑制，過度降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平，從而影響血管收縮功能。另外，隨著藥物劑量的增加，可能出現(xiàn)的副作用也會對總體治療效果產(chǎn)生影響。綜上所述，CaSR對血管張力和血壓調(diào)節(jié)是多靶點、多機(jī)制共同作用的復(fù)雜過程，其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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