陳海燕， 黃建敏， 李雪斌， 蒙蘭青， 郭燦收， 蔣勇明

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病更是中國目前的重大疾病之一。約70%的癲癇患者經(jīng)正規(guī)的AEDs治療后能控制發(fā)作，但仍有30%患者對各種AEDs不敏感而發(fā)生耐藥，發(fā)展為DRE[1]。DRE之所以治療困難，最重要的原因是發(fā)病機制不清楚，無法根據(jù)發(fā)病具體途徑和關鍵環(huán)節(jié)來確定有效治療方案或研發(fā)有效新藥物，同時缺乏DRE形成的早期生物學標志物，給臨床早期診斷帶來很大困難。

研究表明[2]，IREG1能將細胞內無毒的三價鐵離子轉運到細胞外成為有害的二價鐵離子，使鐵離子代謝異常發(fā)生過氧化反應導致神經(jīng)元死亡或凋亡，參與DRE的發(fā)生和發(fā)展。這一觀點已經(jīng)得到了以動物模型及癲癇患者腦組織作為標本的實驗結果支持。但是目前有關IREG1與DRE的相關性以外周血作為標本的相關研究資料尚未見報道。故本研究通過檢測DRE患者外周血中IREG1基因及其蛋白的表達，來探討IREG1在DRE發(fā)病機制中的作用，并探討其作為生物學標志物的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年5月-2017 年1月在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科門診及住院收治的癲癇患者62例。癲癇診斷參照1989年國際抗癲癇聯(lián)盟制定的癲癇和癲癇綜合征的分類標準[3]。排除標準：(1)眩暈、低血糖、暈厥等發(fā)作性疾??；(2)有進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位性病變；(3)有嚴重心、肝、腎疾病患者及不規(guī)律服藥和生活不規(guī)律的患者；(4)妊娠及哺乳期婦女；(5)精神病或智力障礙患者。DRE診斷標準[1]：按照癲癇發(fā)作類型，合理選擇并正確使用至少兩種耐受性好的AEDs，經(jīng)足夠的療程及劑量治療(單藥治療或聯(lián)合用藥)，癲癇無發(fā)作未達到治療前最長發(fā)作間隔時間的3倍或1 y，即耐藥。AEDs控制良好診斷標準：符合2010年ILAE制定的“無發(fā)作”標準[1]，即選用1～2種一線AEDs正規(guī)治療，癲癇無發(fā)作長于3倍治療前最長發(fā)作間期或無發(fā)作長于1 y。根據(jù)DRE診斷標準分為耐藥組和AEDs控制良好組。其中耐藥組32例，男17，女15例，年齡7～68歲，平均年齡(30.8±15.6)歲；AEDs控制良好組30例，男12例，女18例，年齡4～62歲，平均年齡(38.8±15.6)歲。選取同期來院體檢的34名健康人作為正常組，其中男16例，女18例，年齡14～62歲，平均年齡(34.2±13.5)歲。3組在性別及年齡上的差異，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有研究對象在抽血前均簽署知情同意書，此研究已通過本單位的倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器 血液RNA提取試劑盒(北京百泰克公司)，逆轉錄試劑盒、熒光定量擴增試劑盒(TaKaRa公司)，全血蛋白提取試劑盒(上海貝博生物有限公司)，抗IREGl一抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，GAPDH、標記HRP的抗兔二抗、抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)等試劑。主要儀器有熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，PTC-200普通梯度PCR儀、蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，5424R-臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，微量紫外分光光度計Nono-200(杭州奧盛儀器有限公司)等。

1.3 方 法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測外周血中IREG1基因的相對表達量 抽取受檢者清晨空腹靜脈血3 ml，于EDTA抗凝管中，置-80 ℃保存，以備用。實驗過程：(1)引物設計與合成：由TaKaRa生物科技有限公司設計合成，引物序列如下：IREG1上游引物：5’-AAGGGCAAGAATCCCAATTTAACTC-3’；下游引物：5’ -TTCTACATGTAACTTGCCAGGCTGA-3’； 擴增片段大小： 100 bp。GAPDH上游引物：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGG-3’；下游引物：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT -3’;擴增片段大?。?38 bp。(2)提取RNA和合成cDNA。每0.7 ml全血中加入裂解液2 ml，參照Trizol試劑盒的方法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，在冰上操作，按照逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，反應總體系為20 μl。(3)檢測IREG1基因的表達：PCR反應體系為20 μl，其中SYBR Premix混合液10 μl，cDNA2 μl，上下游引物各0.8 μl，加雙蒸水至20 μl。放置熒光定量PCR儀中，循環(huán)數(shù)為40，進行擴增。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，計算出各樣品的目的基因的相對表達量。

1.3.2 蛋白免疫印跡技術檢測患者外周血中IREG1蛋白的相對表達量 每500 μl全血樣本，加入500 μl蛋白提取液和2 μl蛋白酶抑制劑，充分混勻后離心取上清液內含提取蛋白，BCA法蛋白定量為1.5 mg/ml，加蛋白上樣緩沖液，變性后保存。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個泳道蛋白上樣量為20 μg，電泳結束后進行轉膜，將蛋白條帶轉到PVDF膜上，封閉液封閉，室溫搖床震蕩1 h，孵育一抗(內參為GADPH，目的抗體為IREG1，稀釋比例均為 1∶1000)，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜，加入二抗(內參為羊抗鼠，目的為羊抗兔，稀釋比例均為 1∶5000)，常溫孵育2 h，TBST洗膜后暗室曝光。使用Image J圖像處理軟件分析，將IREG1目的條帶灰度值與GADPH的灰度值相比，得出IREG1蛋白的相對表達水平。

2 結 果

2.1 熒光定量PCR結果 耐藥組IREG1 mRNA相對表達量為(1.326±0.102)，良好組為(1.001±0.051)，正常組為(0.643±0.012)，3組間的IREG1基因相對表達水平的差異，具有統(tǒng)計學意義(F=80.5，P=0.000)。經(jīng)LSD法進行兩兩比較，耐藥組顯著高于良好組(P=0.001)；而良好組又顯著高于正常組(P=0.001)(見表1、表2)。

2.2 蛋白免疫印跡結果 耐藥組IREG1蛋白相對表達量為(2.092±0.020)，良好組為(1.779±0.084)，正常組為(1.399±0.083)，3組間的IREG1蛋白相對表達水平的差異，具有統(tǒng)計學意義(F=50.06，P=0.005)。經(jīng)LSD法進行兩兩比較，耐藥組顯著高于良好組(P=0.02)；而良好組又顯著高于正常組(P=0.012)(見圖1、表3、表4)。

表1 3組 IREG l mRNA相對表達量比較

表2 3組IREG1 mRNA相對表達量多重比較

表3 3組IREG1蛋白表達量比較

表4 3組IREG1蛋白表達量多重比較

A:正常組；B:良好組；C:耐藥組

3 討 論

DRE治療效果差，容易反復發(fā)作，甚至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，結果常伴有智能障礙或神經(jīng)功能缺損癥狀，致殘率和致死率都很高，嚴重威脅了患者的身體健康和生活質量。因此探討DRE的發(fā)病機制并尋找其耐藥性形成的早期生物學標志物，對早期診斷和確定可行有效的治療方案,避免耐藥性的發(fā)生具有十分重要的臨床意義。

IREG1是在 2000年由Donovan等[4]最先從斑馬魚中克隆出，編碼基因SLC40A1位于2號染色體上，其mRNA的5’末端非翻譯區(qū)含有一個典型的鐵反應元件，能夠與鐵調節(jié)蛋白相結合調節(jié)鐵離子的轉運[5]。在腦內鐵離子通過參與線粒體氧化反應，DNA、RNA、蛋白質和多種單胺類神經(jīng)遞質的合成等生物代謝過程來維持神經(jīng)細胞的功能，為此鐵離子內環(huán)境的穩(wěn)定是大腦功能穩(wěn)定的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)生理劑量的鐵蓄積也會誘導基因過度表達發(fā)生過氧化反應誘發(fā)疾病[6]。IREG1是將鐵離子從細胞內轉向細胞外最重要的蛋白，病理情況下，IREG1 mRNA和蛋白表達增加，使細胞內大量無毒性的三價鐵離子轉移到細胞外變?yōu)橛卸拘缘膩嗚F離子，導致鐵代謝紊亂，從而誘導多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

實驗表明[7]在大鼠額葉皮質、蛛網(wǎng)膜下腔、杏仁體注射鐵離子均能導致癲癇發(fā)生，均發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)有神經(jīng)元細胞丟失。Guo等[8]通過皮質注射氯化亞鐵可成功建立外傷性癲癇動物模型，大鼠注射氯化亞鐵后出現(xiàn)癲癇發(fā)作，腦電圖表現(xiàn)出尖波、棘波、棘慢波等多種形式癲癇樣放電，病理結果顯示氯化亞鐵注射區(qū)大量神經(jīng)元缺失，膠質細胞增生，以及異常的神經(jīng)元放電環(huán)路。實驗證實了鐵離子導致局部神經(jīng)細胞過度凋亡，進而導致癲癇的發(fā)生。 Zhang等[9]研究對癲癇患者行頭部MRI掃描，發(fā)現(xiàn)其大腦皮質出現(xiàn)了彌漫性鐵沉積，提示異常增加的鐵離子通過脂質過氧化途徑參與癲癇的發(fā)生。國內學者柯賢軍等[2]通過基因芯片技術及RT-PCR方法，對35例DRE患者癲癇切除灶中IREG1 mRNA表達的研究，發(fā)現(xiàn)IREG1 mRNA在DRE患者術后腦組織中存在高表達，提示IREG1在DRE發(fā)病中起著重要的作用。以上研究均證實鐵離子代謝異常參與癲癇的形成，IREG1可以通過鐵離子代謝途徑參與癲癇的發(fā)生與發(fā)展。但這些研究以動物模型及手術切除的癲癇患者腦組織為標本，因存在取材困難、費用高、創(chuàng)傷大等不足，大大限制了臨床研究。因此，本研究通過對DRE患者與AEDs控制良好患者及健康人外周血中IREG1 mRNA及其蛋白表達的檢測來研究IREG1與DRE發(fā)病的相關性。結果顯示IREG1 mRNA及其蛋白在DRE患者外周血中均顯著高于AEDs控制良好患者及健康人。從而證實了IREG1參與DRE的發(fā)生與發(fā)展，并在耐藥機制中起重要作用。IREG1參與DRE的發(fā)病機制可能是：(1)IREG1將無毒的三價鐵離子從細胞內轉移到細胞外成為有毒的二價鐵離子[10]，二價鐵離子與過氧化氫、分子氧等作用而產(chǎn)生自由基，過量的自由基攻擊脂類、DNA和蛋白質，引起細胞發(fā)生嚴重的氧化損傷，誘導組織損傷[11]。(2)蓄積的二價鐵離子通過誘導炎性細胞因子生成的途徑引發(fā)神經(jīng)元的損傷，如催化脂質過氧化花生四烯酸釋放、前列腺素的啟動和白三烯級聯(lián)作用等引起神經(jīng)元變性、死亡[12]。(3)細胞外過多的二價鐵離子還可以通過誘導凋亡相關蛋白生成的途徑進一步引發(fā)神經(jīng)元的損傷，如激活細胞外信號傳導激酶(ERK)，影響骨架蛋白tau的磷酸化[13]，導致神經(jīng)元形態(tài)改變及突觸重構，誘導苔蘚纖維芽生，形成異常興奮性網(wǎng)絡，促進DRE的發(fā)生和發(fā)展。(4)IREG1參與DRE的發(fā)病還可能與銅藍蛋白 (ceruloplasmin，CP)的表達異常有關。CP可氧化二價鐵離子成為三價鐵離子，只有三價鐵離子才能與轉鐵蛋白結合被腦組織攝取，當缺乏CP，IREG1單獨無法發(fā)揮血腦屏障鐵轉運的功能[14]。Zou X等[15]的實驗發(fā)現(xiàn)在皮下注射鐵螯合劑(去鐵胺)，可有效控制氯化亞鐵誘導癲癇模型大鼠癲癇癥狀發(fā)作，顯著降低癲癇模型大鼠大腦皮質神經(jīng)元線粒體內的鐵沉積，減輕線粒體氧化應激損傷的程度，減少神經(jīng)元死亡。提示調控鐵代謝紊亂可有效控制癲癇發(fā)作，即調控IREG1過度表達，有望成為DRE治療新藥開發(fā)的一個新靶點。

綜上所述，本項目研究發(fā)現(xiàn)IREG1基因及其蛋白在DRE患者外周血中表達明顯增加，推測正是這種高表達才使細胞內大量無毒性的三價鐵離子轉移到細胞外變?yōu)橛卸拘缘膩嗚F離子，導致鐵代謝紊亂發(fā)生過氧化反應從而誘導癲癇的發(fā)生與發(fā)展，同時提示IREG1可作為預測癲癇耐藥的外周生物學指標之一。

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