劉 麗， 張 可， 王金春， 曹云鵬

輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment,MCI)是指記憶力或其它認知功能進行性減退，但不影響日常生活能力，且未達到癡呆的診斷標準，是一種介于正常衰老與癡呆之間的認知功能障礙[1]。MCI患者是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病的高危人群。Petersen等的縱向臨床研究表明，MCI以每年10%～15%轉(zhuǎn)化率，高風(fēng)險地轉(zhuǎn)化為癡呆[2]。即使MCI的受試者認知在某一時間點轉(zhuǎn)歸正常，后來發(fā)展為MCI或AD的概率仍高于認知功能正常的人[3]。因此，早期診斷和識別MCI對延緩AD發(fā)生發(fā)展有重要意義。

目前，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的確切病因和發(fā)病機制尚不清楚，但β淀粉樣蛋白(Aβ)在腦組織中的大量沉積被認為是AD病理機制的核心所在，是AD發(fā)病的始動環(huán)節(jié)。脂質(zhì)筏為膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)和蛋白的微區(qū)，富含膽固醇和鞘脂。近年研究表明脂質(zhì)筏在AD的病理發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與Aβ致AD發(fā)病的全過程[4]，而MCI為AD的前期狀態(tài)，所以本研究檢測輕度認知功能障礙患者血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平變化并進行相關(guān)性研究，探討其在MCI診斷中的應(yīng)用價值，旨在尋找MCI的外周血標記物來幫助盡早的診斷MCI，將有助于早期識別AD的高危人群，并對探索有效的治療策略以延緩AD病情進展有重要意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 MCI組 2014年6月-2017年12月于神經(jīng)內(nèi)科診治的MCI患者，所有患者均進行MMSE、蒙特利爾認知評估量表(MoCA)、日常生活能力量表、臨床癡呆評定量表、Hachinski缺血量表和漢密頓抑郁量表評分評定，均符合Peterson制訂的MCI診斷標準和美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第4版(DSM-IV)有關(guān)MCI的診斷標準。

1.1.2 AD組 2014年6月-2017年12月于神經(jīng)內(nèi)科診治的AD患者，所有患者均進行MMSE、蒙特利爾認知評估量表、日常生活能力量表、臨床癡呆評定量表、Hachinski缺血量表和漢密頓抑郁量表評分評定，均符合美國國立神經(jīng)病及語言障礙和卒中研究所-AD和相關(guān)疾病學(xué)會(NINDS-ADRDA)制定的“很可能AD”的診斷標準。

1.1.3 對照組 對照組來自同期體檢中心的健康體檢者，均經(jīng)MMSE評分、蒙特利爾認知評估量表、Hachinski缺血評分證實無明顯記憶障礙，無認知、社交及生活能力受損，無癡呆家族史。

1.1.4 排除標準 (1)腦卒中(包括既往嚴重腦梗死、腦出血等病史，急性腦卒中)；(2)可導(dǎo)致認知功能下降的神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(3)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的內(nèi)科疾病；(4)具有精神疾病病史，嚴重抑郁導(dǎo)致的假性認知障礙；(5)酒、藥物依賴史，曾服用改善認知及抗抑郁的藥物；(6)近期服用過降脂藥及抗血小板聚集類藥物的患者。

1.1.5 該試驗得到我院倫理委員會的批準，并且所有受試者或其家屬均書面簽署了知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 血小板的分離 空腹靜脈抽取全血20 ml，檸檬酸鈉抗凝，200×g室溫離心15 min，小心抽取富含血小板的血漿層，2000×g室溫離心15 min，棄上清。

1.2.2 血小板脂質(zhì)筏的制備[5]將血小板(1×109)用1 ml 4℃預(yù)冷的裂解緩沖液(1% Triton X-100，25 mmol Mes，150 mmol Nacl，1×Protease inhibitor cocktail，pH 6.5)溶解，冰上裂解30 min。向細胞裂解物中加入2 ml 60%的Optiprep，使其終濃度為40%，將其放入超速離心管底部，上層依次覆蓋30%、25%、5%、0%的Optiprep，200000×g于4 ℃超速離心5 h，從上到下依次收集離心樣品10份，每份約1 ml。

1.2.3 脂質(zhì)筏的鑒定 根據(jù)Shrimpton等[5]的方法，將離心后收集的10層樣品點樣于硝酸纖維素膜上，自然晾干，將此硝酸纖維素膜于含5%BSA的PBST中室溫封閉1 h。傾去封閉液，加入含1 μg/ml辣根過氧化物酶標記的霍亂毒素β亞基的PBST，4 ℃孵育過夜。傾去孵育液，用PBS洗膜3次，每次10 min。加入1 ml混合ECL發(fā)光試劑盒中的液體，鋪在LAS3000 mini化學(xué)發(fā)光成像儀中，采集圖像。

1.2.4 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇含量測定 根據(jù)Amplex red cholesterol assay kit試劑盒(美國Invitrogen公司)提供的標準步驟進行。

2 結(jié) 果

2.1 3組受試者的一般資料 MCI組51例，男25例，女26例，平均年齡(66.67±1.51)歲。AD組40例，男19例，女21例，平均年齡(66.95±1.63)歲。對照組52例，男24例，女28例，平均年齡(65.65±1.38)歲。3組在年齡、性別和受教育程度構(gòu)成方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。MCI組和AD組的MoCA總分、MMSE評分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。AD組的MoCA總分、MMSE評分均低于MCI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。血漿總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平在3組之間無差異(見表1)。

2.2 脂質(zhì)筏的鑒定 離心完成后，光照情況下在離心管內(nèi)Optiprep 25%～30% 交界面處可見一條白色的閃亮的環(huán)帶，即為脂質(zhì)筏。點印跡法檢測的結(jié)果亦表明(見圖1)，僅第6層中含有GM1，肉眼所見的處于25%～30%密度梯度離心界面的白色環(huán)帶即在第6層中，因此第6層中的環(huán)帶部分就是我們所需制備的脂質(zhì)筏。

2.3 MCI組、AD組和對照組的血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平的比較 MCI組和AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平分別為(20.65±1.22)μg/ml和(25.68±1.93)μg/ml，均高于對照組(16.11±1.01)μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。MCI組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平低于AD組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(見表1)。

2.4 MCI組、AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與認知功能評分的相關(guān)性分析 血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與年齡、外周血總膽固醇含量無相關(guān)性(P>0.05)。對照組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MoCA、MMSE評分無相關(guān)性(P>0.05)。MCI組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MoCA總分(r=-0.378，P=0.006)及MoCA評分中的延遲回憶(r=-0.296，P=0.035)、注意力和計算力(r=-0.276，P=0.046)、視空間與執(zhí)行功能(r=-0.294，P=0.037)亞項呈顯著負相關(guān)，與MoCA評分中的命名(r=-0.005，P=0.972)、語言能力(r=-0.048，P=0.73)、抽象力(r=-0.003，P=0.983)、定向力(r= -0.111，P=0.439)亞項無相關(guān)性。AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MMSE總分(r=-0.198，P=0.221)及MMSE評分中的定向力(r=-0.175，P=0.281)、即時記憶力(r=-0.011，P=0.948)、注意力和計算力(r=-0.106，P=0.513)、語言能力(r=-0.118，P=0.467)亞項無相關(guān)性，與MMSE評分中的回憶能力(r=-0.337，P=0.033)呈顯著負相關(guān)。

表1 患者的一般資料

與對照組相比*P<0.05，**P<0.01；與MCI組相比#P<0.05，##P<0.01

圖1 點印跡法證實，僅離心后的第6份樣品中含GM1，說明處于25%～30%密度梯度離心界面，即第6份樣品中的白色環(huán)帶為脂質(zhì)筏

3 討 論

輕度認知功能障礙(MCI)平均每年癡呆轉(zhuǎn)化率約10%～15%，明顯高于正常人，已被公認為正常老化與癡呆間的過度狀態(tài)，是AD的重要危險因子[2,6]，因此，MCI的早期診斷和治療是延緩和預(yù)防AD發(fā)生的關(guān)鍵。目前MCI的診斷主要依賴于各種神經(jīng)心理量表檢查，但神經(jīng)心理測試可受多種因素影響，如年齡、文化背景及受教育程度等，在認知功能的早期階段，量表的敏感性和特異性也有較大限制。近年來盡管腦脊液Aβ和tau蛋白已成為最為公認的診斷MCI的生物標記物[7]，但因腦脊液采集的復(fù)雜性和風(fēng)險性，使其臨床應(yīng)用受到很大的限制。本研究探討血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MCI的關(guān)系，以期尋找到對MCI診斷有輔助作用的外周血生物學(xué)標記物，為其早期干預(yù)治療提供科學(xué)依據(jù)。

目前研究表明，Aβ在腦組織沉積是MCI患者最先出現(xiàn)的異常病理改變，其可通過腦脊液或PET技術(shù)檢測出來，并且從Aβ過度沉積到出現(xiàn)臨床癥狀可間隔10 y[8]。Andreasen等研究發(fā)現(xiàn)，MCI患者腦脊液Aβ42水平介于AD和正常對照之間[9]，通過多中心大樣本的研究表明，與穩(wěn)定的MCI相比，發(fā)展為AD的MCI患者的平均Aβ42水平更低[7]。Aβ來自于淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)，通過β和γ分泌酶作用于APP，產(chǎn)生各種長度Aβ片段和一個較小的碳末端片段(CTFγ)[10]。近來研究表明脂質(zhì)筏與AD的病理發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)，脂質(zhì)筏為膜脂雙層內(nèi)含有特殊脂質(zhì)和蛋白的微區(qū)，富含膽固醇和鞘脂，其內(nèi)含有APP、β分泌酶、γ分泌酶及Aβ[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，APP經(jīng)β分泌酶降解形成Aβ的過程在脂質(zhì)筏區(qū)進行，而經(jīng)α分泌酶降解的非淀粉樣蛋白生成途徑在細胞膜的非脂質(zhì)筏區(qū)進行[10]。脂質(zhì)筏不僅參與Aβ的生成，其在Aβ聚集形成低聚體及Aβ低聚體與神經(jīng)元上的受體相結(jié)合而致病等過程中同樣發(fā)揮重要作用[12]。

膽固醇為脂質(zhì)筏內(nèi)的重要成分，主要通過影響脂質(zhì)筏的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)與Aβ生成密切相關(guān)的3種蛋白(APP、β分泌酶和γ分泌酶)在脂質(zhì)筏內(nèi)的分布來促進Aβ的生成[13]。脂質(zhì)筏很小，在正常情況下，APP和β分泌酶可能存在于脂質(zhì)筏內(nèi)，也可能存在于磷脂區(qū)，而且即使位于脂質(zhì)筏區(qū)，APP和β分泌酶也不可能同時存在于同一脂質(zhì)筏內(nèi)。脂質(zhì)筏需要經(jīng)過胞吞而聚集在一起，使APP和β分泌酶相互接觸。當膽固醇水平升高時，脂質(zhì)筏的數(shù)目及體積均增大，含脂質(zhì)筏的質(zhì)膜相對增多，APP及β分泌酶位于同一脂質(zhì)筏內(nèi)的可能性就會增大，進而使Aβ生成增多[14]。Kosicek等觀察到，膽固醇蓄積使APP移入脂質(zhì)筏，進而增加APP在脂質(zhì)筏內(nèi)經(jīng)淀粉樣蛋白生成途徑的降解，促進Aβ生成[13]。與Kosicek的研究結(jié)果相一致，Ehehalt等亦證實，去除膽固醇可減少APP分隔進入脂質(zhì)筏，進而阻止其與β分泌酶及γ分泌酶的相互接觸，抑制β分泌酶對APP的裂解和Aβ的生成。而且，當存活的海馬神經(jīng)元的膽固醇水平下降達70%時，其內(nèi)Aβ的生成將完全停止[14]。此外，膽固醇與Aβ的聚集及毒性作用密切相關(guān)。Kakio等發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜外層膽固醇的增高可加速Aβ的聚集。相反，移除膽固醇后，細胞可抵抗Aβ對其毒性作用[15]。Schneider等研究發(fā)現(xiàn)，從AD患者腦內(nèi)海馬神經(jīng)元的脂質(zhì)筏中分離得到的Aβ低聚體具有膽固醇依賴性，去除膽固醇可使Aβ聚集減少[16]。最新研究表明，GAβ，作為AD早期的病理改變[17]，是神經(jīng)節(jié)苷脂GM1在脂質(zhì)筏內(nèi)結(jié)合Aβ形成，其如同“種子”一樣啟動并加速Aβ的聚集[18]。Fantini等研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)苷脂GM1與Aβ的結(jié)合具有膽固醇依賴性，脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇通過氫鍵驅(qū)動構(gòu)象效應(yīng)作用于神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的糖基，進而促進神經(jīng)節(jié)苷脂GM1與Aβ結(jié)合形成GAβ[19]。

目前，關(guān)于MCI的膽固醇水平的相關(guān)研究結(jié)果說法不一[20～22]，同樣有關(guān)AD患者腦總膽固醇含量的改變情況存在爭議。但Gibson Wood等研究認為，神經(jīng)細胞膜脂質(zhì)雙分子層外層內(nèi)膽固醇水平的持續(xù)升高在AD的發(fā)病過程中起重要作用[23]。因此，與血及腦總膽固醇含量的改變相比，位于脂質(zhì)雙分子層外層的脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇含量的變化可能與AD的發(fā)病更為密切相關(guān)。我們的研究亦表明外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇含量與外周血總膽固醇水平無相關(guān)性，可見，外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平異?？赡芨咛禺愋浴?/p>

人類血小板內(nèi)含有APP及所有APP加工形成Aβ過程中所需的酶，其不但可用于研究AD和MCI患者APP 處理加工和Aβ代謝途徑，還可以用來研究AD和MCI的凋亡途徑和認知功能。因此血小板很有可能成為AD和MCI診斷的合適的外周標記物來源[24]。本研究中，我們檢測外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平，發(fā)現(xiàn)MCI組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平高于對照組，低于AD組，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平可能是MCI的生物學(xué)標志物指標之一。AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平較對照組明顯增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平檢測對AD的診斷具有重要的意義。我們對血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MCI、AD患者的認知功能進行了相關(guān)性分析，MCI組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MoCA總分及MoCA評分中的延遲回憶、注意力和計算力、視空間與執(zhí)行功能亞項呈顯著負相關(guān)，說明脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇參與了認知損害的致病過程，血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平升高是早期輕度認知功能受損的重要表現(xiàn)，其水平的高低在一定程度上能夠反映MCI患者認知功能障礙的程度。MCI組和AD組血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平均與神經(jīng)心理量表中的延遲回憶(回憶能力)呈顯著負相關(guān)，說明血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平變化在一定程度上與MCI和AD早期最常見的臨床表現(xiàn)相一致，血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平有望成為MCI和AD早期診斷的生物標記物。

綜上所述，檢測外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平對早期診斷MCI患者具有一定的臨床應(yīng)用價值，有望成為MCI和AD早期診斷和病情評估的重要生物學(xué)標記物。當然，外周血血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平檢測對MCI的診斷價值尚缺乏大樣本多中心數(shù)據(jù)支持，在后續(xù)的研究中，將盡量擴大樣本量，減少偏倚，以便進一步證實血小板脂質(zhì)筏內(nèi)膽固醇水平與MCI之間真正存在相關(guān)性。

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