陳 良， 余 鋒， 劉曉敏

腦血管病包括缺血性和出血性腦血管病，其中缺血性腦血管病占80%～85%，缺血性腦血管病以血栓或栓塞引起血管閉塞為特征，大腦中動脈是最常見的梗死發(fā)生部位[1]。腦卒中后，炎癥損傷已被公認(rèn)是主要的損傷機制，閉塞后的再灌注通過增加氧自由基的產(chǎn)生，進一步加劇了神經(jīng)元的損傷[2]。

白三烯(LTs)是5-脂氧合酶(5-LOX)作用于花生四烯酸(AA)的代謝物，是公認(rèn)的強效促炎物質(zhì)[3]。脂氧素(LXs)是內(nèi)源性“炎癥制動信號”家族中的一員，在炎癥中與白三烯作用相反。脂氧素A4(LXA4)作為最重要的脂氧素之一，與其耦聯(lián)的G蛋白稱為脂氧素A4受體(ALXR)。Boc2是ALXR的特異性拮抗劑。側(cè)腦室注射LXA4后通過局部過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)介導(dǎo)的腦缺血損傷調(diào)節(jié)作用機制，目前仍不是很清楚[4]。

已證明抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)可減小腦梗死體積[5]，但很少有研究探討LXA4在神經(jīng)保護作用中的機制，因此我們模擬了腦缺血/再灌注的大鼠模型(MCAO/R)來闡明LXA4對神經(jīng)的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物與模型 SPF級10～12 w齡雄性Wistar，體重250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。MCAO建模：水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，解剖右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，頸總動脈近心端血管夾夾閉短暫阻斷血流，將0.28 mm的MCAO專用線栓通過頸外動脈遠(yuǎn)端插至頸內(nèi)外動脈分叉處，線栓到達(dá)大腦中動脈起始段為止，絲線打結(jié)固定線栓，2 h后抽回線栓以恢復(fù)灌注。假手術(shù)組以相同的手術(shù)方式操作但不阻斷血流。所有手術(shù)操作均在無菌條件下完成，操作前肌注青霉素8萬單位預(yù)防感染。整個過程中體溫維持儀監(jiān)測和保持體溫在37 ℃，激光多普勒血流儀(Periflux System 5000)在造模前后監(jiān)測局部腦血流量。排除標(biāo)準(zhǔn)：局部腦血流量減少未達(dá)70%以上，在實驗過程中死亡和在腦組織提取過程中發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物。

隨機法將動物分為4組，每組10只，其中5只用于TTC染色，5只用于WB和ELISA檢測。(1)對照組：假手術(shù)大鼠側(cè)腦室注射5 μl生理鹽水；(2)MCAO/R組：建模后側(cè)腦室注射5 μl生理鹽水；(3)LXA4組：建模后側(cè)腦室注射5 μl LXA4(0.2 mmol/L)；(4)LXA4+Boc2組：建模后側(cè)腦室注射4 μl LXA4(0.25 mmol/L)和1 μl Boc2(10 mmol/L)。

1.2 方 法

1.2.1 神經(jīng)功能評估 MCAO/R 24 h后，神經(jīng)功能評分。0分：沒有神經(jīng)缺陷；1分：未能充分張開對側(cè)前爪；2分：拖尾時對側(cè)前肢抓地力下降；3分：自動盤旋或向健側(cè)行走；4分：沒有自發(fā)的運動活動；5分：對刺激沒有任何反應(yīng)。

1.2.2 腦含水量測定 使用濕/干方法測定同側(cè)(假手術(shù)組)或缺血半球的含水量。新鮮大腦半球稱重后置于100 ℃烘箱中烘烤24 h，稱得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3 腦梗死體積百分比 制備2 mm腦片，腦片于2%的TTC染液中37 ℃避光30 min。染色后拍照，應(yīng)用Photoshop CS 5.0軟件進行分析。所有腦片的梗死面積之和即為總梗死面積，乘以腦片的厚度即是梗死體積。為了排除腦水腫的影響，計算如下:校正的梗死體積=健側(cè)半球體積-(患側(cè)半球體積-患側(cè)半球梗死體積)，水腫校正后梗死體積百分比(%)=(校正的梗死體積/健側(cè)半球體積)×100%。

1.2.4 Western blot RIPA法提取腦總蛋白，BCA法測定蛋白濃度：40 μg蛋白樣品在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，雜交一抗5-LOX (1∶200)；ERK和磷酸化ERK1/2(1∶500)；p38和磷酸化p38(1∶500)；JNK和磷酸化JNK (1∶500)，4 ℃孵育過夜，過夜的纖維素膜徹底漂洗后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)在37 ℃孵育1 h。洗膜后電化學(xué)發(fā)光液(ECL)曝光顯影，Image J軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.2.5 ELISA 額頂葉大腦皮質(zhì)組織，按照組織(mg)：PBS(μl)=1∶10的比例充分勻漿組織至無肉眼可見的組織塊，4 ℃，3000 rpm離心20 min，取上清作為待測樣品。根據(jù)大鼠ELISA試劑盒說明書檢測大腦皮質(zhì)中花生四烯酸代謝產(chǎn)物白三烯LTB4和LTC4的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 LXA4對神經(jīng)功能、腦含水量、梗死體積百分比的影響 神經(jīng)功能評分：假手術(shù)組沒有任何缺損，實驗組評分為(2.83±0.41)。LXA4組的評分顯著降低，Boc2拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖1A)。與假手術(shù)組相比，MCAO/R組缺血半球腦含水量顯著增加(P<0.05)。LXA4顯著降低了腦含水量(P<0.05)，且可被Boc2阻斷(P<0.05)(見圖1B)。MCAO/R組腦缺血明顯，梗死體積百分比高達(dá)(76.4±2.84)，LXA4明顯降低了梗死體積百分比(P<0.05)。LXA4 +Boc2組中梗死體積百分比相對于LXA4組顯著升高(P<0.05)，但仍低于MCAO/R組(P<0.05)(見圖1C、D)。

2.2 LXA4對5-LOX的影響 MCAO/R模型中5-LOX表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，其表達(dá)可被LXA4抑制(P<0.05)。而且Boc2部分拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖2A、B)。同時，我們還檢測了LTB4和LTC4的表達(dá)水平(P<0.05)(見圖2C、D)。

2.3 ERK信號通路 ERK激活體ERK1/2的磷酸化水平在MCAO/R模型顯著增加。LXA4明顯抑制了ERK1/2的磷酸化水平(P<0.05)，Boc2拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖3A)。然而JNK和p38的磷酸化水平改變，無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B、C)。

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組&P<0.05

圖1 LXA4對神經(jīng)功能、腦含水量、腦梗死體積百分比的影響

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組相比&P<0.05

圖2 LXA4對5-LOX及其產(chǎn)物L(fēng)TB4、LTC4的影響

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組相比&P<0.05

圖3 LXA4對ERK 信號途徑的影響

3 討 論

急性腦缺血和隨后的再灌注引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)是腦缺血后損傷的關(guān)鍵因素，機制包括細(xì)胞內(nèi)鈣超載、ROS、蛋白水解酶系統(tǒng)的過度活化和促炎細(xì)胞因子的釋放[6]。因此，炎癥成為卒中治療的潛在靶點。5-LOX受各種刺激后，易位至核膜，與蛋白FLAP結(jié)合成為復(fù)合物，該復(fù)合物再將AA轉(zhuǎn)換為LTs[7]。動物和臨床研究均顯示5-LOX和LT參與了腦缺血再灌注損傷，抑制5-LOX后表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護作用[8，9]。Ciceri等[10]的研究顯示MK-886(LTs生物合成抑制劑)降低了LTs的表達(dá)并減小了大鼠腦梗死體積。但是，Kitagawa等[11]的研究顯示5-LOX基因缺陷小鼠在局灶性腦缺血期間并沒有起到保護作用。該研究中，MCA閉塞后第一天做神經(jīng)功能評分，但卻在MCA閉塞后的第7天測量梗死體積，兩參數(shù)不在同一時間點，所以該實驗的設(shè)計存在缺陷。因為在MCA閉塞后幾天內(nèi)，由于梗死引發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了梗死體積的擴大[12]，可能掩蓋了5-LOX的保護作用。5-LOX的保護作用可能只有在病理條件下才變得明顯，而且生理活動要求酶具有基礎(chǔ)的活性，酶的完全失活是有害的，因此采用基因敲除動物進行實驗，結(jié)果可能不夠具有代表性[13]。

最近，LXs這一來源于5-LOX的脂質(zhì)介質(zhì)也引起了關(guān)注。與LXs相關(guān)的疾病包括哮喘、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎、腎炎、囊性纖維化和各種感染[14]。LXA4的性質(zhì)包括減少ROS的產(chǎn)生、對鈣通道的影響和減輕急性肺損傷等。Sobrado等[15]首次觀察到外源性LXA4介導(dǎo)PPARγ來保護腦組織免受缺血再灌注損傷，同時作者還發(fā)現(xiàn)PPARγ激動劑可以調(diào)節(jié)5-LOX和LTs的產(chǎn)生，這可能至少部分地解釋了LXA4的神經(jīng)保護作用。

我們進一步研究LXA4在卒中治療中的潛在作用以及5-LOX/LTs在這種情況下的作用。盡管先前報道LXA4的神經(jīng)保護作用是由PPARγ介導(dǎo)的，但LXA4的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過ALXR介導(dǎo)的。我們將Boc2與LXA4同時給藥，發(fā)現(xiàn)LXA4對腦梗死、腦水腫和神經(jīng)功能缺損的保護作用只是部分通過ALXR介導(dǎo)的，表明LXA4可能是炎癥模型中LTs的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子[16]。因為它的作用并未被Boc2完全阻斷，顯然還有其他受體參與，例如PPARγ[15]。

我們的研究結(jié)果顯示腦缺血再灌注誘導(dǎo)ERK磷酸化、5-LOX激活和LTs合成，表明ERK 1/2在缺血再灌注后的腦損傷中發(fā)揮著重要作用。但是p38和JNK的磷酸化水平無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與動物種類、實驗?zāi)Ｐ?、取材位置和研究時間點有關(guān)。

綜上所述，我們的研究表明，LXA4可以阻止5-LOX的激活，減少腦缺血再灌注模型誘導(dǎo)的LTs的產(chǎn)生，并且該通路是LXA4在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護作用的基礎(chǔ)；LXA4能抑制強效促炎介質(zhì)LTs的產(chǎn)生，LXA4的神經(jīng)保護作用可能是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的，近期曹翔等人[17]的研究表明，LX007可以調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，再次證明抗炎應(yīng)成為腦卒中的治療靶點。

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