陳哲，馮佳悅，曹誠，柯炎波，楊潤，余海忠，王海燕

（湖北文理學院食品科學技術(shù)學院·化學工程學院，湖北襄陽441053）

麥冬（Ophiopogon japonicus）首次被人知曉于《神農(nóng)本草經(jīng)》，系百合科沿階草屬多年生常綠草本植物麥冬的塊根[1]。按其產(chǎn)地不同主要分為湖北麥冬、川麥冬以及杭麥冬[2]。其中湖北麥冬（Liriope spicata Lour.var.prolifera Y.T.Ma），因主產(chǎn)于湖北襄陽歐廟一帶而又俗稱為襄麥冬。作為道地藥材，襄麥冬已獲國家地理標志產(chǎn)品保護，由于其塊根單產(chǎn)高于川、杭麥冬，且生產(chǎn)周期短，目前已成為中藥麥冬的主流商品[3]。麥冬含有多糖、甾體皂苷、高異黃酮和氨基酸等成分[4]。對于其主要活性成分之一的麥冬多糖和皂苷的研究如今國內(nèi)外蒸蒸日上，研究結(jié)果也日新月異。諸多研究發(fā)現(xiàn)麥冬多糖和皂苷具有較高的藥理活性和醫(yī)用價值，例如保護心血管內(nèi)皮細胞[5]，改善心肌缺血[6]、調(diào)節(jié)免疫[7]、改善三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的大鼠結(jié)腸炎[8]、抗衰老[9]、抗糖尿病作用[10]、抗腫瘤作用[11]等。前期對襄麥冬多糖的提取工藝[12]以及襄麥冬皂苷B誘導腫瘤細胞分化[13]進行了研究，本研究擬對襄麥冬多糖的體外清除活性以及襄麥冬皂苷B的抑菌活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

襄麥冬：湖北省襄陽市歐廟鎮(zhèn)。襄麥冬皂苷B：上海源葉生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由湖北文理學院食品科學技術(shù)學院·化學工程學院孫永林老師惠贈。葡萄糖標準品：西安化學試劑廠；蒽酮（分析純）：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；95%濃硫酸：展望化工試劑有限公司；95%乙醇：西隴化工股份有限公司；無水乙醇：西隴化工股份有限公司；DPPH：上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

LD-Y300A粉碎機：上海頂帥電器有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HX-OIN抽濾機：恒信世紀科技有限公司；UV-2600PC紫外/可見光分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；AL204型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DL-CJ-2NDI超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LKH-250OF生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 襄麥冬多糖的提取及其抗氧化活性研究

1.3.1.1 葡萄糖標準曲線的繪制

1）試驗原理

多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，并且迅速脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛與蒽酮脫水縮合，反應生成的糠醛的衍生物在波長625 nm處有峰值，反應溶液呈現(xiàn)藍綠色，反應液顏色與溶液中所含的糖的濃度成正比[14]。

2）標準葡萄糖溶液的配制

用電子天平稱取0.02 g的標準葡萄糖，用少量蒸餾水溶解后定容于200 mL的容量瓶（容量瓶使用前采用蒸餾水潤洗）中配成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液混勻待用。

3）葡萄糖溶液標準曲線回歸方程的建立

取6支試管，用準確吸取0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液 0、2、4、6、8、10 mL，再取蒸餾水 10、8、6、4、2、0 mL依次注入6支試管搖勻；6支試管分別加入4 mL的0.2%蒽酮-硫酸溶液，迅速浸入冷水中冷卻，各管冷卻后一同放入沸水水?。ㄔ嚬芸诩由w防止蒸發(fā)），準確沸水浴10分鐘后取出，用冷水冷卻后放至室溫，倒入比色皿中，于波長625 nm處比色，測量吸光度。以同樣處理過的蒸餾水作為空白進行比色，以吸光度為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，做出葡萄糖標準曲線。

1.3.1.2 襄麥冬多糖的提取

1）熱水浸提醇沉法原理

由于多糖溶于水而不溶于醇、醚和丙酮等有機溶劑，熱水浸提醇沉法[15]主要利用水的熱力作用致使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，讓水作為溶劑滲透進細胞壁和細胞質(zhì)當中，從而溶解液泡當中的物質(zhì)，使這些物質(zhì)能夠通過細胞壁，擴散至外部溶劑中[16]。醇沉就是利用雜質(zhì)溶于乙醇但有效成分不能溶于乙醇的特性，將雜質(zhì)去除[17]。

2）熱水浸提醇沉法實驗流程

采用文獻[18-19]中麥冬熱水浸提醇沉法的最優(yōu)工藝條件提取襄麥冬多糖，選擇提取率高者進行后續(xù)實驗。將麥冬置于60℃的干燥箱中24h烘干后使用植物粉碎機將其粉碎成粉末，并使用保鮮膜密封保存（防止受潮而影響后期實驗）備用。取兩個燒杯分別標記為1號代表第一種方法、2號代表第二種方法，用電子天平分別稱取80 g襄麥冬粉末，分別加入800、2400 mL蒸餾水，待水浴鍋達到80℃時放入燒杯恒溫水浴2 h，再將所得溶液抽濾，除去沉淀，將所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下濃縮，1號加入4倍體積的80%的乙醇[20]，2號加入4倍體積的95%的乙醇，兩管均醇沉過夜，之后9000 r/min，離心15 min后除去溶液，再將所得沉淀干燥，即得多糖制品。試驗重復4次取平均值。參照參考文獻[21]，稱取多糖制品，加入蒸餾水稀釋，根據(jù)標準曲線公式計算得到多糖濃度，根據(jù)以下公式計算多糖含量：

多糖含量/%=[（c×V）/m]×100

式中：c為多糖濃度，（mg/mL）；V 為多糖體積，mL；m 為多糖的質(zhì)量，mg。

1.3.1.3 襄麥冬多糖的體外抗氧化活性測定

1）襄麥冬多糖清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一種具有一定穩(wěn)定性的有機自由基[21]，它的溶液具有特征的紫紅色吸收峰，當存在自由基清除劑的時候，由于DPPH自由基與其單電子配對而導致其吸收逐漸消失，其褪色程度與它所接受到的單電子數(shù)成定量關(guān)系，因此可以用分光光度法進行定量分析[22]。

參照參考文獻[23]，取5支10 mL的容量瓶分別標記為 1、2、3、4、5，向 5 支容量瓶中分別加入 0.1 mg/mL的多糖溶液 2、4、6、8、10 mL，然后加入蒸餾水定容，制成濃度依次為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的襄麥冬多糖的稀釋液，搖勻待用。

取 5 支試管，分別注入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的襄麥冬多糖的稀釋液1 mL和0.2 mmol/L的DPPH溶液（溶劑為無水乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用。）1 mL振蕩搖勻，靜置30 min后在波長517nm處測得吸光度Ai，對照組用1 mL 50%的乙醇代替DPPH與上述5組溶液1 mL振蕩搖勻在波長517nm處測得吸光度Aj，以1 mL DPPH與1 mL 50%乙醇的混合溶液在波長517 nm處測得的吸光度Ac，以1 mL蒸餾水和1 mL 50%乙醇混合溶液作為空白調(diào)零。計算襄麥冬多糖對DPPH自由基的清除率公式表示為：

清除率/%=[Ac-（Ai-Aj）]/Ac×100

2）襄麥冬多糖清除羥自由基（·OH）的能力

參照參考文獻[24]，取5支試管依次向其中加入2.0 mmol/L 的 FeSO4溶液 2.0 mL、1.0 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻后再加入6.0 mmol/L水楊酸3.0 mL，搖勻后于37℃水浴加熱15 min。水浴結(jié)束后于波長510 nm處測得吸光度A0。之后向5支試管中分別加入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的襄麥冬多糖的稀釋液1 mL，水浴加熱15 min，等待加熱結(jié)束后再次分別測量其吸光度AX。用2 mL蒸餾水代替1.0 mmol/L H2O2重復上述實驗，在510 nm處測得吸光度AX0，試驗重復3次取平均值。襄麥冬多糖羥自由基清除率計算公式為：清除率/%=[A0-（AX-AX0）]/A0×100

3）襄麥冬多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力

采用鄰苯三酚自氧化法來檢測麥冬多糖對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除能力。首先將PH8.2的Tris-HCL緩沖液與鄰苯三酚溶液于25℃恒溫水浴箱中保溫20 min，取5支試管分別加入4.5 mL Tris-HCL緩沖液，再分別加入 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的襄麥冬多糖的稀釋液0.4 mL，以及鄰苯三酚溶液0.1 mL，振蕩搖勻后在25℃下恒溫水浴，準確反應4 min，立即加入10 mol/L HCl溶液2滴終止反應，于波長325nm處測得樣品吸光度A2[25]。以蒸餾水代替多糖溶液作為對照吸光度A1，以緩沖液和蒸餾水的混合溶液作為空白調(diào)零。襄麥冬多糖超氧陰離子自由基（O2-·）的清除率公式表示為：

清除率/%=[（A1-A2）/A1]×100

1.3.2 襄麥冬皂苷B抑菌活性研究

1.3.2.1 培養(yǎng)基的制備

稱取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，氯化鈉5 g，將1000 mL水加熱至沸騰后，再將牛肉膏、蛋白胨、瓊脂和氯化鈉加入溶解。pH值調(diào)至7.4，將培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋中溫度為121℃，滅菌20 min，放入干燥箱中備用。

1.3.2.2 菌懸液的制備

先將菌種接于平板，放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h。取9只已滅菌的試管依次從0開始編號，然后在編號為0的試管中加入10 mL無菌生理鹽水，其他8只試管中加入9 mL無菌生理鹽水。然后用接種環(huán)從平板中挑取一定量的菌于0號試管中，以其做為稀釋的起始濃度，采用10倍系列稀釋依次得到1至8號菌液。取3號和6號試管備用。

1.3.2.3 含菌平板的制備

把已滅好菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別倒入8個培養(yǎng)皿中，等培養(yǎng)基凝固后，用移液槍吸取菌懸液0.3 mL加入培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用涂布勾將加入的菌懸液涂抹均勻，制成含菌平板。

1.3.2.4 抑菌試驗

參照參考文獻[26]，用無菌水溶解襄麥冬皂苷B并將其分別配制成0.5、1.0、2.0、4.0 mg/m L的皂苷溶液。將已滅菌的直徑為5.5 mm濾紙片分別浸入上述4種不同濃度的麥冬皂苷溶液中浸泡2 h。取出待其自然干燥后，用紫外線照射滅菌10 min～15 min。用無菌鑷子將浸透4種濃度麥冬皂苷溶液的濾紙片放在含菌平板上。然后將已處理好的培養(yǎng)皿放到生化培養(yǎng)箱中，在溫度為37℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測定抑菌圈的大小，判斷不同濃度的麥冬皂苷溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。

1.3.2.5 抑菌效果的判定標準

抑菌圈直徑＞15 mm時為高度敏感，10 mm～15 mm時為中度敏感，7 mm～9 mm時為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 16.0進行處理并做統(tǒng)計分析，配對t檢驗比較兩種最優(yōu)工藝提取多糖含量，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 葡萄糖標準曲線

以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of glucose

由圖1可知，回歸方程y=8.4686x+0.0146，R2=0.9981，回歸方程線性良好。

2.2 襄麥冬多糖的提取

比較熱水浸提醇沉法的兩種最優(yōu)工藝提取的襄麥冬多糖含量，結(jié)果見表1。

表1 不同提取條件下的襄麥冬多糖含量（±s，n=4）Table 1 Polysaccharide content under different extraction conditions from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma

表1 不同提取條件下的襄麥冬多糖含量（±s，n=4）Table 1 Polysaccharide content under different extraction conditions from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma

試驗方法 多糖含量/% P值（t檢驗）143.25±0.83 0.075241.94±0.24

由表1中數(shù)據(jù)可知，80 g襄麥冬粉末中加入800 mL的蒸餾水，80℃水浴鍋中恒溫水浴2 h后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用80%的乙醇醇沉過夜所得到的多糖含量較高。由于P=0.075＞0.05，可知1號提取麥冬多糖含量與2號沒有顯著差異，選擇含量較高的1號方法進行后續(xù)實驗。

2.3 襄麥冬多糖的體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 襄麥冬多糖清除DPPH自由基的能力

對襄麥冬體外清除DPPH自由基的能力進行研究，結(jié)果如圖2所示。

圖2 襄麥冬多糖體外清除DPPH自由基的能力Fig.2 Effect of polysaccharide on the DPPH free radical scavenging

由圖2可以看出，麥冬多糖對DPPH自由基具有一定的清除能力，當襄麥冬多糖濃度為0.1 mg/mL時，對DPPH自由基的清除作用最強，高達21.08%，并且隨著稀釋倍數(shù)的增加，溶液中多糖含量的降低，對DPPH自由基的清除能力也有相應的降低，呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。

2.3.2 襄麥冬多糖清除羥自由基（·OH）的能力

采用了水楊酸法對襄麥冬體外清除羥自由基的能力進行了研究，結(jié)果如圖3所示。

圖3 襄麥冬多糖體外清除羥自由基（·OH）的能力Fig.3 Effect of polysaccharide on the hydroxyl radical（·OH）scavenging

根據(jù)圖3的數(shù)據(jù)顯示，襄麥冬多糖對于羥自由基具有一定的清除能力，并且隨著多糖濃度的增加，對于羥自由基的清除能力也具有相應的加強，當襄麥冬多糖濃度為0.1 mg/mL時對羥自由基清除作用最強，高達25.69%。

2.3.3 襄麥冬多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）的能力

采用鄰苯三酚自氧化法對襄麥冬體外清除超氧陰離子自由基的能力進行研究，結(jié)果如圖4所示。

圖4 襄麥冬多糖體外清除超氧陰離子自由基的能力Fig.4 Effect of polysaccharide on the scavenging activity of superoxide anion radical

根據(jù)圖4可以看出，襄麥冬多糖對于超氧陰離子自由基的清除能力較強，當襄麥冬濃度為0.1 mg/mL時，襄麥冬多糖對超氧陰離子的清除能力最高達70.83%。可以看出襄麥冬多糖對于超氧陰離子自由基的清除作用與溶液中多糖含量具有一定的關(guān)系，隨著襄麥冬多糖濃度的增加，對于超氧陰離子自由基的清除能力也相應的增強。

2.4 襄麥冬皂苷B體外抑菌活性檢測結(jié)果

采用濾紙片法對襄麥冬皂苷B的抑菌活性進行研究，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度的襄麥冬皂苷B對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果（±s）Table 2 Bacteriostatic effect of different concentrations liriopesides B from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma（±s）mm

表2 不同濃度的襄麥冬皂苷B對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果（±s）Table 2 Bacteriostatic effect of different concentrations liriopesides B from Liriope Spicata Lour.var.Prolifera Y.T.Ma（±s）mm

注：-表示無明顯抑菌圈。

3 號 - - 11.63±0.33 17.05±0.676號 - - - -襄麥冬皂苷B濃度0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 4.0 mg/mL大腸桿菌 3號 - - 10.83±0.82 14.89±0.506號 - - - -金黃色葡萄球菌菌種 試管號

由表2可得，在襄麥冬皂苷B溶液濃度為2.0、4.0 mg/mL時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果比較明顯，金黃色葡萄球菌對皂苷溶液比大腸桿菌更加敏感。其中金黃色葡萄球菌對4.0 mg/mL的襄麥冬皂苷B極度敏感。

3 結(jié)論與討論

熱水浸提醇沉法是目前較為常見提取多糖的方法之一，這種方法雖然所消耗的勞動力強度也相對較大[27]，并且多糖是一種熱敏性的物質(zhì)[28]，長時間處于高溫環(huán)境下會影響到它的生物活性，但是熱水浸提醇沉的方法提取多糖對實驗設備需求不高，而且操作非常簡單，成本低廉，準確度也較高，對于大規(guī)模的生產(chǎn)以及大部分實驗室的提取工藝都很適合[29]。當然除了熱水浸提醇沉法之外，還有很多方法可以提取多糖，例如超聲波提取法、酶提取法以及微波提取法等。其中超聲波提取法[30]是利用超聲產(chǎn)生的強烈的空氣振蕩，致使細胞壁破裂，更有效的加速有效成分進入溶劑，減少了提取時間，加大了提取效率，但是這種方法相對熱水浸提醇沉法的方法來說對設備的需求要高出很多，并不適合大規(guī)模的生產(chǎn)操作，并且可溶性的多糖隨著超聲作用時間加長還可能會發(fā)生降解，并溶解在乙醇溶液中，因此會減少多糖的提取量。襄麥冬多糖體外抗氧化活性檢測表明其對自由基具有一定的清除能力，其中對超氧陰離子自由基清除率最高，羥自由基次之。主要原因在于，多糖可以與超氧陰離子自由基發(fā)生氧化反應，從而達到清除目的，對于單線態(tài)氧，可以將激發(fā)能傳遞給多糖，使得多糖處于激發(fā)態(tài)而它自身則回到基態(tài)；羥自由基可以快速的攝取多糖碳氫鏈上的氫原子結(jié)合成水，而多糖的碳原子上則留下一個單電子，成為碳自由基，氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產(chǎn)物[31]。研究表明，植物提取物羅漢果花皂苷對細菌、霉菌和釀酒酵母均具有較強的抑菌活性[32]。玉米須中總皂苷對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和白葡萄球菌有明顯的抑制作用[33]。柚皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，對沙門氏菌的抑制作用較弱[34]。本研究結(jié)果表明，襄麥冬皂苷B具有明顯的抑菌活性，其對金黃色葡萄球菌的抑制能力強于大腸桿菌。

綜上所述，襄麥冬多糖對自由基具有一定的清除能力，其中對超氧陰離子自由基的清除作用相對較強，最高達到70.83%。襄麥冬皂苷B對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有明顯的抑菌活性，尤其對金黃色葡萄球菌的抑菌作用更強，其最大抑菌圈為（17.05±0.67）mm，此研究成果可為襄麥冬產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供重要理論參考。

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