畢云楓，李娜，姜珊，王溪竹，鄭明珠，劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

糖尿病患者除了血糖水平增高外，蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的代謝紊亂等并發(fā)癥是這種慢性疾病最常見的綜合征[1]。目前，糖尿病也是人類最重要的健康問題之一[2]。降低餐后高血糖癥的最受歡迎的治療方法之一是抑制α-糖苷酶，這是糖代謝和消化的重要原因[3]。由腸溶消化酶（α-糖苷酶）消化的復(fù)合多糖以葡萄糖的形式降解[4]。人體吸收后，這些葡萄糖會(huì)滲入血液，致使餐后高血糖。因此，通過抑制α-糖苷酶來減緩各種多糖的消化被認(rèn)為是糖尿病治愈的關(guān)鍵治療方法[5]。研究者發(fā)現(xiàn)使用含有多種多糖的天然產(chǎn)物可以降低餐后血糖濃度。在吸收和消化過程中可以通過抑制腸膜內(nèi)的葡萄糖擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)[6]。最近，使用沒有任何副作用的天然治療藥物更多應(yīng)用于這種慢性疾病的治療[7]。由于天然產(chǎn)物的功效性及安全性，對(duì)天然產(chǎn)物衍生的α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究也日益增多。相關(guān)文獻(xiàn)總結(jié)了用于治療2型糖尿病（Type 2 Diabetes－Mellitus，T2DM）的天然產(chǎn)物或醫(yī)療植物[8]，說明天然產(chǎn)物是α-葡萄糖苷酶抑制劑的豐富來源。

人參是一種Panax屬的多年生草本植物（Araliaceae family），也是一種高價(jià)值和受歡迎的藥用植物。在中國(guó)、美國(guó)、俄羅斯、日本以及韓國(guó)和加拿大等多個(gè)國(guó)家，人參被大量栽培。人參植物根系用于傳統(tǒng)東方醫(yī)學(xué)幾千年。其藥理學(xué)特性主要?dú)w因于人參皂苷，不同人參皂苷的活性有所不同[9]。日本科學(xué)家早在20世紀(jì)20年代就已經(jīng)證明了人參根皂苷對(duì)抗糖尿病有極大的作用。過去十幾年，人參及其組分在降血糖疾病中的研究有顯著增加。人參皂苷組分具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性，這也是其對(duì)高血糖疾病具有有效作用的決定因素。對(duì)人參皂苷的作用機(jī)理研究表明，它們確有降血壓、降血糖、抗疲勞等功效。此后，人參皂苷在降血糖的領(lǐng)域被廣泛研究。本文正是借鑒過往經(jīng)驗(yàn)，深入對(duì)人參皂苷Re、Rg2對(duì)α-糖苷酶的抑制作用加以研究。

1 材料與儀器

1.1 材料

人參皂苷Re、Rg2，純度＞99%：吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase 750 U/g）：美國(guó) Sigma公司；阿卡波糖：四川綠葉寶光藥業(yè)有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：上海寶曼生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電子天平（FA1004B）：上海佑科儀器儀表有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：Japan Kyoto。

2 方法

2.1 相關(guān)溶液的配制

2.1.1 磷酸鹽緩沖液

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）：稱取磷酸二氫鈉1.94 g、磷酸氫二鈉1.92 g，用蒸餾水配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，并調(diào)為pH6.8，用微孔濾膜過濾，備用。

2.1.2 配制α-葡萄糖苷酶溶液

將凍干酶粉用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解，配置成6 U/mL的溶液。再將酶液分別稀釋配制成 0.2、0.3、0.4、0.5、1.0 U/mL 的酶溶液，冷凍備用。

2.1.3 配制底物PNPG溶液

精確稱取0.3766 g PNPG，加入適量0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH6.8）溶解，再用容量瓶準(zhǔn)確定容到50 mL，配制成250 mmol/L的母液，將母液分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mmol/L 不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.2 確定反應(yīng)體系

2.2.1 最佳酶液體積

在反應(yīng)體系中分別加入α-葡萄糖苷酶酶液（0.3 U/mL）0、10、20、30、40 μL 反應(yīng) 15 min 后，在波長(zhǎng)405 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度，決定酶液體積對(duì)葡萄糖生成量的影響，確定最佳加酶量。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的確定

在反應(yīng)體系中加入酶液后，分別在 5、7、9、11、13、15、17 min后用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度，確定反應(yīng)的最佳時(shí)間。

2.2.3 做標(biāo)準(zhǔn)曲線

用磷酸鹽緩沖液（pH6.8）配制為濃度1000 μmol/L的對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），并稀釋成 400、300、200、150、100、50、0 μmol/L 7 種不同的濃度，將不同濃度的PNP各取160 μL，加入80 μL Na2CO3（0.2 mol/L）混勻，在405 nm下用紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度OD1，測(cè)量3組平行試驗(yàn)后取平均值。將吸光度值OD作為縱坐標(biāo)，對(duì)硝基苯酚濃度作為橫坐標(biāo)，繪制曲線。

酶活力單位定義：pH6.8、3℃的條件下，每分鐘水解底物所產(chǎn)生的1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

2.2.4 α-葡萄糖苷酶的活力測(cè)定

110 μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）和1%的DMSO 8 μL放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應(yīng)后，加入20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)405 nm下測(cè)吸光度OD2。做3組平行試驗(yàn)。

2.2.5 酶活性抑制率及計(jì)算

阿卡波糖的抑制：110 μL磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）、1%的 DMSO 8 μL和50 μL不同濃度的抑制劑，放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應(yīng)后，加入 20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)405 nm下測(cè)吸光度OD3。做3組平行試驗(yàn)。

Re、Rg2的抑制：110 μL 磷酸鹽緩沖液（pH6.8），加入 30 μL α-葡萄糖苷酶（0.3 U/mL）、1%的 DMSO 8 μL和50 μL不同濃度的抑制劑，放在37℃10 min（恒溫）的條件下反應(yīng)后，加入 20 μL PNPG（2.5 mmol/L）放在37℃溫度下繼續(xù)反應(yīng)10 min，最后加入Na2CO3（0.2 mol/L）80 μL終止反應(yīng)，在吸光度405 nm下測(cè)吸光值OD4。做3組平行試驗(yàn)。

空白組為①磷酸鹽緩沖液＋酶：用緩沖溶液補(bǔ)足到反應(yīng)體積，測(cè)吸光度OD1。做3組平行試驗(yàn)；②磷酸鹽緩沖液+抑制劑+酶：用緩沖溶液補(bǔ)足到反應(yīng)體積，測(cè)吸光度OD3。做3組平行試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用不同濃度的PNP進(jìn)行反應(yīng)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 對(duì)硝基苯酚光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of optical density of p-nitrophenol

3.2 確定α-葡萄糖苷酶酶量對(duì)反應(yīng)體系的影響

在以PNPG為底物與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行的反應(yīng)體系中，最終測(cè)得PNP分解量的吸光度值隨著酶量的增加而增大，這可以表現(xiàn)出α-葡萄糖苷酶的活性。在其他組分濃度不變的條件下，酶量越大反應(yīng)速度越快，當(dāng)酶濃度為0.3 U/mL，體積為30 μL時(shí)，酶量與反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)良好的線性反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶量對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.2 Effect of enzyme volume on the reaction system

最終反應(yīng)體系選定為酶量30 μL進(jìn)行酶活性的測(cè)定。

3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響如圖3所示。

在反應(yīng)體系進(jìn)行時(shí)，從第5分鐘開始每隔2分鐘測(cè)一下吸光度，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15 min時(shí)，吸光度值出現(xiàn)了平衡期，數(shù)值不再上升，因此我們判定反應(yīng)體系的最佳時(shí)間即為10 min。

3.4 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制

阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制見圖4。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.3 Effect of reaction time on the reaction system

圖4 阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制Fig.4 Acaconose inhibition of α-glucosidase activity

采用不同濃度的阿卡波糖進(jìn)行反應(yīng)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用呈現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系，抑制曲線與阿卡波糖濃度成正比，尤其當(dāng)濃度在2mg/mL～8 mg/mL的區(qū)間內(nèi)，抑制率明顯隨著濃度增大而增大。

因此可以判斷本實(shí)驗(yàn)體系符合α-葡萄糖苷酶體外抑制模型符合此次大規(guī)模的篩選需要。

3.5 不同濃度的人參皂苷Re、Rg2對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制

測(cè)量不同濃度的人參皂苷Re、Rg2對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制，以人參皂苷Re、Rg2濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，抑制率（%）為縱坐標(biāo)，繪制的曲線，結(jié)果如圖5、圖6所示。

圖5 人參皂苷Re對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.5 Inhibition curve of ginseng extract Re on α-glucosidase

圖6 人參皂苷Rg2對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制曲線Fig.6 Inhibition curve of ginseng extract Rg2on α-glucosidase

當(dāng)濃度在2 mg/mL～8 mg/mL時(shí)，人參皂苷Re、Rg2對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制有著良好的量效關(guān)系，抑制曲線與皂苷濃度成正比。這兩種人參皂苷均對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性有明顯抑制作用，當(dāng)濃度較低時(shí)，Re對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率要比Rg2高，反之，則Rg2對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率要比Re高，然而同陽性對(duì)照阿卡波糖相比較，這兩種人參皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用都有所不及。

4 結(jié)論

隨著社會(huì)的發(fā)展、進(jìn)步，人類生活水平的日益提升，T2DM的患病率不可避免的與日俱增。T2DM具體特征表現(xiàn)為胰島素抵抗和胰腺β細(xì)胞功能障礙，且是一種復(fù)雜的異種多發(fā)性疾病。由于胰腺β細(xì)胞的死亡或功能的喪失，會(huì)引起餐后胰島素分泌受損，致使高血糖且隨后胰島素敏感性下降。因此，迫切需要更好的治療方法和T2DM的新型預(yù)防策略。為解決這一難題，科研人員開始建立適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)和體外模型。迄今為止，一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂捎糜谘芯縏2DM，然而，通過調(diào)整現(xiàn)有方法或通過開發(fā)新方法或兩者的組合，來繼續(xù)追求建立T2DM更好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪歉玫耐緩健ｋm然有個(gè)別幾種藥物對(duì)治療糖尿病有很好的療效，但都具有極大的副作用或不良反應(yīng)。因此，近些年大量研究人員開始尋求天然產(chǎn)物或飲食干預(yù)來預(yù)防或治療T2DM。數(shù)千年來，隨著醫(yī)學(xué)實(shí)踐，中醫(yī)藥傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)積累了大量寶貴的經(jīng)驗(yàn)。截至目前，人參成為了治療糖尿病最有效替代藥物之一。人參在我國(guó)是特有的一種珍貴藥材，幾千年來食用人參的傳統(tǒng)一直得以延續(xù)。而糖尿病可以導(dǎo)致各種各樣的疾病及代謝紊亂，是一種頑固的疾病且在全球年發(fā)病率一直持續(xù)增加[10]。在人體中，葡萄糖耐受作用在高血壓發(fā)生之前即受到抑制[11-12]，廣泛用作檢測(cè)糖尿病的臨床指標(biāo)。人參的藥理作用主要?dú)w因于人參皂甙，主要分為原人參二醇型人參皂苷（protopanaxdiolcas，PDG），如人參皂甙 Rb1，Rb2，Rc，Rd，Rg3和 Rh2以及原人參三醇型人參皂甙（protopanaxatriol，PTG），如人參皂苷 Rg1。PDG 組中的糖部分連接到C-3位，而PTG基團(tuán)連接在C-6位上。以前的大量研究已經(jīng)可以證明人參皂苷Rb1對(duì)降血糖具有良好的作用。而本試驗(yàn)則是首次利用人參皂苷Re、Rg2進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，并且通過數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，最終達(dá)到了預(yù)期效果。

酶活性的影響因素有很多，為了有一個(gè)良好的反應(yīng)體系，此試驗(yàn)優(yōu)化了酶量和反應(yīng)時(shí)間。結(jié)果表明，酶量用30 μL，反應(yīng)時(shí)間10 min為最佳狀態(tài)，這其中不足之處就是人參皂苷Re、Rg2的最大溶解度是8 mg/mL，否則將會(huì)有更好的抑制效果。人參皂苷能有效抑制α-葡萄糖苷酶的體外活性，由于體內(nèi)抑制和體外抑制兩者之間具有很大差異，所以還需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步通過體內(nèi)模型來研究人參皂苷的抑制效果，并提供一些體內(nèi)降血糖的理論依據(jù)。

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