鄒青飛，吳躍中，楊士花，李永強(qiáng)，*，張一鳴，李雪良，郭馨昕

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南省耿馬傣族佤族自治縣氣象局，云南臨滄677500；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)外語(yǔ)學(xué)院，云南昆明650201）

色素分為天然色素和合成色素兩種。天然色素主要從植物中提取，也有一部分從動(dòng)物和微生物中提?。缓铣缮丶慈斯ず铣傻纳?，主要以苯胺為原料制成[1-2]。研究表明，大部分合成色素均有不同程度的毒性，危害人體健康；與之相比，天然色素安全性較高、具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥理作用，同時(shí)天然色素著色時(shí)色調(diào)更接近天然物質(zhì)的顏色，所以天然色素具有良好的開(kāi)發(fā)前景[3-7]。

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）為仙人掌屬，原產(chǎn)南北美洲熱帶、亞熱帶大陸及附近一些島嶼。目前在云南，廣西，海南等地有種植。仙人掌果含有較多的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、果膠和豐富的微量元素，具有行氣活血、祛濕退熱、生肌等功效[8]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)仙人掌果色素的初步定性，以吸光度為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，確定該色素的最優(yōu)提取工藝，并對(duì)該色素進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)定。旨在為今后仙人掌果色素資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，促進(jìn)我國(guó)天然色素的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

仙人掌果：云南省大理市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、1，1-二苯基-2-苦基肼基（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2-azinobis（3-ethylbenzothia-zoline）-6-sulfonate，ABTS）、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tris（2-pyridy1）-S-tria-zine，TPTZ）、三氯化鐵、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、抗壞血酸：上海純生化科技股份有限公司；阿魏酸、兒茶素：北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800CP紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色素的初步定性

準(zhǔn)確稱(chēng)取9份1 g樣品，置于研缽中分別加入10 mL配好的鹽酸甲醇、鹽酸乙醇、1%鹽酸、60%乙醇、80%乙醇、60%甲醇、丙酮、石油醚、蒸餾水，研磨、過(guò)濾，分別用不同的提取溶劑定容于50 mL容量瓶中，在190 nm～1100 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最佳提取溶劑和最大吸收波長(zhǎng)，并對(duì)色素進(jìn)行初步定性。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以吸光度為指標(biāo)，分析不同條件下提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度和液料比值對(duì)仙人掌果色素提取效率的影響。

1.3.2.1 提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶，加入10mL80%乙醇作為提取溶劑，在室溫下（25℃）分別提取1、2、3、4次，提取時(shí)間為1.5h，過(guò)濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別于272nm和324 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶，加入10 mL 80%乙醇作為提取溶劑，在室溫下（25 ℃）分別提取 0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數(shù)為2次，過(guò)濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別于272nm和324nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2.3 提取溫度對(duì)色素提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶，加入10 mL 80%乙醇作為提取溶劑，分別在 20、30、40、50、60、70 ℃下進(jìn)行提取，提取次數(shù)為2次，提取時(shí)間為1.5 h，過(guò)濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別于272 nm和324 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2.4 液料比值對(duì)色素提取率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g樣品置于研缽中將其磨碎并轉(zhuǎn)移至100 mL 錐形瓶，之后分別加入 5、10、15、20、25、30 mL的80%乙醇作為提取溶劑，于室溫下（25℃）提取1.5 h，提取次數(shù)為2次，過(guò)濾后用提取溶劑將濾液定容于100 mL容量瓶中，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別于272 nm和324 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)[9-15]

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定仙人掌果色素的最優(yōu)提取工藝。

1.3.4 體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 色素溶液制備

稱(chēng)取1 g新鮮仙人掌果，在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行色素提取，之后將提取的色素溶液定容于50 mL容量瓶備用。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定（DPPH radical scavenging activity，DRSA）

取1 mL色素提取液與4 mL DPPH甲醇溶液混合，之后進(jìn)行渦旋振搖，將兩者混合物室溫下暗處放置10 min，然后于517 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DPPH自由基的清除率[16-17]。利用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

式中：y為DPPH自由基清除率，%；x為阿魏酸濃度，μmol/L；每克樣品中DPPH自由基清除能力相當(dāng)于阿魏酸的微摩爾數(shù)（μmol FAE/g）。

DPPH自由基清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A0為DPPH溶液本身吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力測(cè)定（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）

FRAP溶液配制：將乙酸緩沖溶液（300 mmol/L，pH3.6）、六水三氯化鐵（20 mmol/L）和三吡啶基三嗪（10 mmol/L）以體積比10∶1∶1充分混勻制成FRAP溶液。

取3 mL的FRAP溶液與1 mL色素提取液充分混合，于37℃下反應(yīng)4 min，用乙醇做空白，在593 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16-19]。用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)方程為：

式中：y為吸光度；x為硫酸亞鐵濃度，mmol/L；每克樣品中鐵離子還原能力相當(dāng)于Fe2+的微摩爾數(shù)（mmol FE/g）。

1.3.4.4 總抗氧化能力測(cè)定（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）

將2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀與7 mmol/L的ABTS等體積混合，于4℃條件反應(yīng)16 h配制得到ABTS工作液。取0.05 mL的色素提取液與1.9 mL的ABTS工作液室溫條件反應(yīng)6 min，用乙醇作為空白，于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ABTS+·清除能力[16，20-21]。利用Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為：

式中：y為 ABTS+·清除率，%；x為 Trolox濃度，mmol/L；每克樣品中ABTS+·清除能力相當(dāng)于Trolox的微摩爾數(shù)（μmol TE/g）。

ABTS+·清除率/%=[（A0-A1）/A0]×100

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.3.4.5 還原能力測(cè)定（reducing power，RP）

吸取1 mL的色素提取液，加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6），2.5 mL10%三氯乙酸溶液，混合均勻后加入2.5 mL10%TCA溶液，于4000 g離心10 min；取上清1 mL加入0.5 mL 0.1%FeCl3溶液和2.5 mL蒸餾水，用乙醇作為空白對(duì)照，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[16，22-23]。用抗壞血酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立標(biāo)準(zhǔn)方程為：

式中：y為吸光度；x為抗壞血酸濃度，μmol/L；每克樣品中還原能力相當(dāng)于抗壞血酸的微摩爾數(shù)（μmol AAE/g）。

1.3.4.6 過(guò)氧化氫清除能力測(cè)定（hydrogen peroxide scavenging activity，HPSA）

取0.3 mL色素提取液加入0.5 mL的H2O2（40 mmol/L），再加入0.75 mL磷酸鈉緩沖溶液（45 mmol/L，pH 7.4），在 30℃下暗反應(yīng) 40 min，用乙醇作為空白對(duì)照于230 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度[16，24-25]。用阿魏酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為：

式中：y為H2O2清除率，%；x為阿魏酸濃度，μmol/L；每克樣品中H2O2清除能力相當(dāng)于阿魏酸的微摩爾數(shù)（μmol FAE/g）。

式中：A0為H2O2自身吸光度；A1為樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙人掌果色素初步定性

仙人掌果色素全波長(zhǎng)掃描見(jiàn)圖1。

圖1 仙人掌果色素在各溶劑中的吸收波長(zhǎng)Fig.1 The absorption wavelength of cactus fruit pigment in various solvents

由圖1可知，仙人掌果色素易溶于醇類(lèi)溶劑，微溶于蒸餾水，不溶于石油醚，該色素為醇溶性色素。80%乙醇提取條件下的吸光度最大，故選取80%乙醇作為提取溶劑。同時(shí)可以看出，在272 nm和324 nm處出現(xiàn)波峰，故色素的最大吸收波長(zhǎng)為272 nm和324 nm。初步定性仙人掌果色素為黃酮醇類(lèi)色素[26-27]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響

提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 272 nm和324 nm條件下提取次數(shù)對(duì)色素提取率的影響Fig.2 The effect of extraction times on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖2可知，在波長(zhǎng)為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后平緩的趨勢(shì)，且272 nm波長(zhǎng)下吸光度始終大于324 nm波長(zhǎng)下吸光度，當(dāng)提取2次后吸光度逐漸趨于平緩。分析原因可能為：當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，色素基本提取完全。故選取2次為最佳的提取次數(shù)。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 272 nm和324 nm條件下提取時(shí)間對(duì)色素提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖3可知，在波長(zhǎng)為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且272 nm波長(zhǎng)下吸光度始終大于324 nm波長(zhǎng)下吸光度，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，吸光度達(dá)到最大，272 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.596，324 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.323。分析原因可能為，色素隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而被氧化。故選取1.5 h為最佳提取時(shí)間。

2.2.3 提取溫度對(duì)色素提取率的影響

提取溫度對(duì)色素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 272 nm和324 nm條件下提取溫度對(duì)色素提取率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖4可知，在波長(zhǎng)為272 nm和324 nm的提取條件下，吸光度隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，且272 nm波長(zhǎng)下吸光度始終大于324 nm波長(zhǎng)下吸光度，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大，272 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.580，324 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.178。分析原因可能為：色素在過(guò)高溫度下會(huì)氧化分解。故選取60℃為最佳提取溫度。

2.2.4 液料比值對(duì)色素提取率的影響

液料比值對(duì)色素提取率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 272 nm和324 nm條件下液料比值對(duì)色素提取率的影響Fig.5 The effect of the ratio of liquid and material on the extraction rate of pigment under the conditions of figure 272 nm and 324 nm

由圖5可知，在波長(zhǎng)為272 nm和324 nm提取條件下，吸光度隨著提取液料比值的升高呈現(xiàn)先上升后平緩趨勢(shì)，且272 nm波長(zhǎng)下吸光度始終大于324 nm波長(zhǎng)下吸光度，當(dāng)提取液料比值為10時(shí)，吸光度達(dá)到最大。之后隨著液料比值的增加，吸光度趨于平緩。分析原因可能為：隨著液料比值的增加，色素被全部提取。故選取10 mL/g為最佳提取液料比值。

2.3 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

因素水平編碼表見(jiàn)表3，二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 因素水平編碼表Table 3 Factor level coding table

表4 二次通用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Scheme and results of two general rotation test

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與檢驗(yàn)

用DPS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次回歸模型為：

Y(272nm)=0.42745-0.06927X1+0.01018X2+0.03225X3-0.03281X12+0.00062X22+0.00111X1X22+0.01306X1X3+0.00574X2X3

Y(342nm)=0.16693-0.02830X1+0.00780X2+0.01429X3-0.01611X12-0.00042X22-0.00095X32-0.00067X1X2+0.00885X1X3+0.00375X2X3。

2.3.2 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行272 nm波長(zhǎng)方差分析

回歸方程方差分析見(jiàn)表5。

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Variance analysis table of regression equation

由表5可知，擬合檢驗(yàn)P=0.0061＜0.01，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)P=0.1363＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著。說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映色素提取率與提取溫度、液料比值和提取時(shí)間的關(guān)系。

2.3.3 變量轉(zhuǎn)換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.68≤Xi≤1.68（i＝1，2，3）范圍內(nèi)，每個(gè)因素取 5 個(gè)水平（±1.68，±1，0），對(duì)53＝125個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可得吸光度的最高值為0.52，此時(shí)各因素取值為：X1＝-1，X2=-0.06，X3＝0.35，對(duì)應(yīng)著提取溫度為 40 ℃，提取時(shí)間為0.97 h，液料比值為11.75 mL/g。

2.3.4 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)

各變量取值的頻率分布見(jiàn)表6。

由表6可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)的優(yōu)化方案為：提取溫度為37.24℃～43.68℃，提取時(shí)間為0.84h～1.16 h，液料比值為 10.42 mL/g～13.22 mL/g。為了貼近實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：提取溫度為40℃，提取時(shí)間為1 h，液料比值為12 mL/g。對(duì)該方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出色素溶液在272 nm下吸光度為0.5169，與優(yōu)化的最佳值0.52較為接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方案的可靠性。

表6 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 6 The frequency distribution table of Xi value in the optimization extraction scheme

2.3.5 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行324 nm波長(zhǎng)方差分析

回歸方程方差分析見(jiàn)表7。

表7 回歸方程方差分析表Table 7 Variance analysis table of regression equation

由表7可知，擬合檢驗(yàn)P=0.016＜0.05，達(dá)到顯著水平，失擬檢驗(yàn)P=0.1793＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著。說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映色素提取率與提取溫度、液料比值和提取時(shí)間的關(guān)系。

2.3.6 變量轉(zhuǎn)換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，在-1.68≤Xi≤1.68（i＝1，2，3）范圍內(nèi)，每個(gè)因素取 5 個(gè)水平（±1.68，±1，0），對(duì)53＝125個(gè)方案進(jìn)行統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)，在試驗(yàn)范圍內(nèi)可得吸光度的最高值為 0.2，此時(shí)各因素取值為：X1＝-1，X2=-0.1，X3＝0.372，對(duì)應(yīng)著提取溫度為40℃，提取時(shí)間為0.95 h，液料比值為11.86（mL/g）。

2.3.7 頻率分析及統(tǒng)計(jì)尋優(yōu)

各變量取值的頻率分布見(jiàn)表8。

表8 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布表Table 8 The frequency distribution table of Xi value in the optimization extraction scheme

由表8可以看出，在95%的置信區(qū)間內(nèi)的優(yōu)化方案為：提取溫度為38.42℃～45.04℃，提取時(shí)間為0.84 h～1.16 h，液料比值為 11.02 mL/g～13.86 mL/g。為了貼近實(shí)際的工業(yè)化生產(chǎn)，可將優(yōu)化方案定為：提取溫度為40℃，提取時(shí)間為1 h，液料比值為12 mL/g。對(duì)該方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出色素溶液在324 nm下吸光度為0.1984，與優(yōu)化的最佳值0.2較為接近，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方案的可靠性。

2.4 體外抗氧化能力測(cè)定

仙人掌果色素的5種體外抗氧化能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 仙人掌果色素抗氧化能力測(cè)定Table 9 Determination of antioxidant capacity of the pigment in Opuntia ficus-indica

3 結(jié)論

仙人果色素易溶于乙醇和甲醇，微溶于蒸餾水，不溶于石油醚，確定該色素為醇溶性色素，最大吸收波長(zhǎng)為272 nm和324 nm。經(jīng)初步定性，仙人掌果色素為黃酮醇。仙人掌果色素最優(yōu)提取工藝參數(shù)：提取溫度40℃，提取時(shí)間1 h，液料比值12 mL/g，提取次數(shù)2次。仙人掌果色素的體外抗氧化試驗(yàn)顯示：仙人果色素具有較強(qiáng)的抗氧化性。

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