魏芳，周祥山，田守生，劉海峰，張建嶺，郭曉飛，郭興峰，，*

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252000；2.東阿阿膠股份有限公司，山東聊城252201）

阿膠（Colla corii asini）為馬科動物驢（Equus asinus L.）的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，屬我國傳統(tǒng)名貴滋補類中藥，也是衛(wèi)生部規(guī)定的藥食兩用資源[1]。阿膠可追溯到2500多年以前，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《傷寒雜病論》、《本草經(jīng)集》、《名醫(yī)別錄》《齊民要術(shù)》、《本草綱目》等眾多中醫(yī)著作中均有記載，具有補氣養(yǎng)血、滋陰潤燥等功效，被譽為補血圣藥，與人參、鹿茸一起稱為“中藥三寶”[2-3]?，F(xiàn)代研究表明：阿膠含有膠原蛋白、肽和多種微量元素，對人體的血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等均具有重要作用[4-6]。傳統(tǒng)阿膠塊炮制服用方法繁瑣且不易吸收，對于脾胃虛弱，消化能力低下的血虛、貧血病人，阿膠藥效得不到充分發(fā)揮，因此，阿膠素有“滋膩礙胃”之說[7]。

通過現(xiàn)代酶解技術(shù)將阿膠中的膠原蛋白水解為阿膠低聚肽是解決阿膠食用繁瑣、攜帶不便、吸收率低等問題的有效途徑，也是傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化的有效途徑[7]。阿膠低聚肽與眾多其他來源多肽相似，均具有較重的苦味[8-11]。如何降低苦味就成為多肽風(fēng)味改善的重點和難點[8，10，12-13]。目前，多肽的苦味脫除方法大體有：選擇分離法、掩蓋法、酶法、微生物法等[14]。選擇分離法是一種采用吸附、萃取、沉淀、色譜分離等方法將蛋白酶解液中具有苦味的多肽予以除去的方法。其中，樹脂分離法因具有吸附性能好、比表面積大等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于生物制藥及天然植物活性成分的提取分離中[15-17]。

以阿膠低聚肽為原料，通過靜態(tài)、動態(tài)吸附和解吸試驗，考察了AB-8、DA201-C、DA-201C和D101等4種不同規(guī)格的大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽的吸附、解吸和脫苦效果，并確定了最佳的脫苦工藝，應(yīng)用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）研究了分離前后樣品氨基酸組成和分子量分布的差別，旨在為阿膠低聚肽的脫苦提供理論依據(jù)，同時為低苦味阿膠低聚肽產(chǎn)品的進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿膠低聚肽原粉：東阿阿膠股份有限公司；DA-201C、AB-8、D-101型大孔吸附樹脂（孔徑8 nm～10 nm）：天津浩聚樹脂科技有限公司；DA201-C型大孔吸附樹脂（孔徑10 nm）：鄭州華溢科技新材料股份有限公司；95%乙醇：萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；鹽酸：煙臺市雙雙有限公司；無水醋酸鈉（分析純）：吳江市華順精細(xì)化工有限公司；冰醋酸（分析純）：湖北興銀河精細(xì)化工有限公司；乙腈（色譜純）：山東豐倉化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式多用真空泵：鄭州博科儀器設(shè)備有限公司；大孔吸附樹脂用層析柱；OSB-2100式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛郎儀器有限公司；FD-1C-50式真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；ME204/02式電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LC-100高效液相色譜儀：合肥捷島科學(xué)儀器有限公司；Vensil-AA氨基酸分析方法包（Vensil-AA氨基酸分析專用柱、異硫氰酸苯酯、三乙胺、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、正亮氨酸）：天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹脂的預(yù)處理

將不同型號的大孔吸附樹脂先用一定量的無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，然后將樹脂裝柱，用4～5倍床層體積的無水乙醇以2 BV/h～3 BV/h的流速通過樹脂，至流出液在220 nm處無吸收峰，再用去離子水以3 BV/h～4 BV/h的流速沖洗至無乙醇味備用[18]。

1.3.2 靜態(tài)吸附及解吸試驗

1.3.2.1 靜態(tài)吸附試驗

于250 mL具塞錐形瓶中分別加入50 g預(yù)先處理過的樹脂，再加入100 mL濃度為0.2 g/mL的阿膠低聚肽溶液。用塞子封好后放入20℃的恒溫?fù)u床中振蕩3 h（140次/min），從搖床上取出靜置 3 h[19]。每隔半小時攪拌一次，使吸附完全。將每個錐形瓶中的溶劑分別進行抽濾并用50 mL去離子水洗滌，把抽濾得到的濾液進行濃縮、冷凍干燥、稱重，并按下式計算吸附當(dāng)量。抽濾剩下的干燥固體樹脂收集備用。

吸附當(dāng)量/（mg/g）=吸附量/干樹脂質(zhì)量

1.3.2.2 靜態(tài)解吸試驗

將經(jīng)靜態(tài)吸附后得到的干燥固體樹脂分別置于500 mL具塞錐形瓶中，各加入200 mL無水乙醇。用塞子封好后放入20℃的恒溫?fù)u床上振蕩3 h（140次/min）。從搖床上取出，將錐形瓶中的溶劑進行抽濾。得到的溶液進行濃縮，冷凍干燥。將得到的干燥粉末進行稱重，按下式計算解吸率。

解吸率/%=解吸量/吸附量×100

1.3.3 動態(tài)吸附及解吸試驗

采用濕法裝柱將經(jīng)過預(yù)處理的大孔吸附樹脂裝入層析柱中，距柱口約3cm～4cm[20]。分別根據(jù)靜態(tài)吸附及解吸試驗結(jié)果，確定的每種樹脂最佳上樣量稱取阿膠低聚肽粉末，按阿膠低聚肽粉末∶去離子水=1 g∶5 mL的比例加入去離子水。用磁力攪拌器攪拌20 min，超聲波超聲30 min。待阿膠低聚肽完全溶解后，將其緩慢加入到裝好的柱子中。分別用25%乙醇和95%乙醇以1 BV/h～2 BV/h的速度洗脫4種大孔吸附樹脂，得到的流出液分別按瓶進行收集、濃縮、冷凍干燥。并將得到的干燥固體粉末進行稱重，按下式計算每種大孔吸附樹脂動態(tài)吸附及解吸后的回收率。

回收率/%=總回收量/上樣量×100

1.3.4 苦味評價

目前，常用的口嘗苦味評價方法有排序法、評分法、排序加評分法[21]。本文采用排序法和評分法對阿膠低聚肽溶液的苦味進行評價，苦味評價方法均參照文獻[21]。

1.3.4.1 排序法

將25%乙醇分別洗脫4種大孔吸附樹脂得到的干燥固體粉末配制成濃度為2%的樣品溶液，95%乙醇洗脫樹脂得到的干燥固體粉末配制成濃度為1%的樣品溶液。

以6個感官評價員為一組，每名感官評價員需分別評定兩組共8個樣品。每組樣品評定的時間間隔40 min，每個樣品間隔時間為2 min～3 min。評價員在感官評定前2小時禁食，感官評價前用水漱口，取少量溶液放入口中，使樣品充分與味蕾接觸，15 s后吐出漱口，并按照品嘗到的苦味大小按從大到小的順序排列。

1.3.4.2 評分法

以鹽酸奎寧為參比，將配制好的樣品溶液分別與濃度為 1.0×10-4、9.0×10-5、8.0×10-5、7.0×10-5、6.0×10-5、5.0×10-5、4.0×10-5、3.0×10-5、2.0×10-5、1.0×10-5g/mL 的鹽酸奎寧做對比，其苦味值分別定為10～1。每位感官評價員按品嘗到的苦味強度進行打分并取平均值[22]。

1.3.5 阿膠低聚肽分子量分布的測定

阿膠低聚肽分子量分布的測定參考GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中大豆肽粉的分子量分布的測定方法應(yīng)用HPGPC進行測定。色譜條件：色譜柱TSK gel 2000 swxl 300 mm×7.8 mm，流動相：乙腈-水-三氟乙酸=45∶55∶0.1（體積比），檢測波長：220 nm，流速：0.5 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。樣品制備：以流動相為溶劑配制濃度為2 mg/mL的樣品溶液并用0.45 μm微孔膜過濾后進樣。標(biāo)準(zhǔn)樣品：將乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸（Mw=189）、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸（Mw=451）、桿菌酶（Mw=1450）、抑肽酶（Mw=6500）、細(xì)胞色素C（Mw=12500）配成混標(biāo)，每種物質(zhì)含量均為2 mg/mL。將5種標(biāo)準(zhǔn)樣品按2 mg/mL配制，按照上述色譜條件測定并以lgMw為縱坐標(biāo)，以保留時間為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 5種標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPGPC圖譜及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 HPGPC profiles of five standard samples

從圖1中可以看到洗脫峰出現(xiàn)時所對應(yīng)的洗脫時間分別為 12.749、14.041、16.871、19.104、20.767 min，以分子質(zhì)量對數(shù)值與洗脫時間作圖，求出直線的回歸方程為：y=-0.227x+6.991（式中：x為洗脫時間，y為分子質(zhì)量對數(shù)），其回歸系數(shù)R2=0.963。

1.3.6 阿膠低聚肽中氨基酸分析

阿膠低聚肽中氨基酸種類和含量測定使用Venusil AA氨基酸分析方法包進行測定[23]，分別精確稱取80 mg～90 mg阿膠低聚肽及經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂分離后的樣品于安瓿瓶中，加入6 mol/L鹽酸，混勻，封口，110℃烘箱中水解24 h。取水解液濃縮至干燥，加入稀鹽酸溶解后，用0.45 μm濾膜過濾，取過濾液貯于0～4℃冰箱中，供衍生使用。準(zhǔn)確量取上述配制好的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液200 μL置于1.5 mL離心管中，依次加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液、三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯溶液，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷，振搖后放置10 min，取下層溶液用0.45 μm的針式過濾器過濾。取部分濾液用水稀釋，搖勻，進樣。色譜條件：Venusil AA氨基酸分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL，柱溫：40 ℃，流動相，A：稱取15.2 g無水醋酸鈉，加水1850 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值至6.5，然后加乙腈140 mL，混勻，用0.45 μm濾膜過濾。流動相B：80%（體積比）乙腈溶液，流速：1.0 mL/min，梯度洗脫，對經(jīng)阿膠低聚肽分離前后的氨基酸進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸試驗

不同型號大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽的吸附與解吸性能見表1。

表1 不同型號大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽的吸附與解吸性能Table 1 Adsorption and desorption capabilities of Colla corii asini oligopeptides with different kinds of macroporous adsorptive resins

從表1可以看出，大孔吸附樹脂AB-8的吸附當(dāng)量最大，依次是D-101、DA201-C，最后是DA-201C。另外比較解吸率可知，DA-201C的解吸率均高于另外3種樹脂。由于，AB-8、D-101和DA-201C3種樹脂的解吸量和吸附量差別較大，不適用于阿膠低聚肽的分離。因此，結(jié)合吸附量和吸附當(dāng)量的結(jié)果可知，大孔吸附樹脂DA201-C對阿膠低聚肽的分離效果最好。

2.2 4種大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附與解吸試驗

不同型號大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽的動態(tài)吸附性能結(jié)果見表2。

表2 不同型號大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽的動態(tài)解吸性能Table 2 Dynamic desorption capabilities of Colla corii asini oligopeptides with different kinds of macroporous adsorptive resins

由表2可以看出，4種大孔吸附樹脂的洗脫率都達(dá)到了90%以上。而其中用25%乙醇洗脫所得組分占了上樣量的大部分比例，用95%乙醇得到的洗脫量較小，可能是因為相對分子量較大的組分在95%乙醇中溶解度降低所致[24]，同時說明通過大孔吸附樹脂分離不會對樣品造成較大的損失。

2.3 苦味的評價

2.3.1 排序法結(jié)果與分析

不同型號大孔吸附樹脂分離阿膠低聚肽后各組分的苦味排序見表3。

由表3可知，大孔吸附樹脂DA-201C用25%乙醇洗脫時得到的洗脫液苦味最重，D-101和AB-8次之，DA201-C的苦味最輕；而用95%乙醇洗脫組分中DA-201C苦味最輕，AB-8和D-101次之，DA201-C苦味最重。趙謀明等[25]認(rèn)為，蛋白水解物苦味的產(chǎn)生，是由于蛋白質(zhì)在水解過程中疏水性氨基酸殘基暴露在多肽末端引起。因此，大孔吸附樹脂DA201-C和AB-8能夠較好的脫除阿膠低聚肽的苦味，是因為在一定比例乙醇洗脫時可以有的吸附一定量的疏水性氨基酸。

表3 經(jīng)不同型號大孔吸附樹脂分離阿膠低聚肽組分的苦味排序Table 3 The bitter sequence of fractions of Colla corii asini oligopeptides separated by different kinds of macroporous adsorptive resins

2.3.2 評分法結(jié)果與分析

不同型號大孔吸附樹脂的評分結(jié)果見表4。

表4 不同型號大孔吸附樹脂的評分結(jié)果Table 4 Results of different macroporous adsorptive resins

結(jié)合表3和表4可知，排序法與評分法的結(jié)果一致。從表4可以看出，當(dāng)用25%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時，得到的阿膠低聚肽組分苦味值最小，為1.3；DA-201C用95%乙醇洗脫時，苦味值為6.3。結(jié)合動態(tài)吸附與解吸的試驗結(jié)果可知，DA201-C大孔吸附樹脂具有最佳的脫苦效果。

2.4 分離前后阿膠低聚肽的分子量分布

通過前期分離和感官評價后發(fā)現(xiàn)DA201-C對阿膠低聚肽具有較好的脫苦效果，隨后對分離前后的阿膠低聚肽分子量分布情況進行了分析。分析結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 原阿膠低聚肽的分子質(zhì)量分布Fig.2 MolecularweightdistributionofCollacoriiasinioligopeptides

圖3 乙醇洗脫后阿膠低聚肽的分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular weight distribution of Colla corii asini oligopeptides ethanol elution

如圖2所示，原阿膠低聚肽溶液中包含3個組分峰，洗脫時間分別出現(xiàn)在20.086、21.207、23.276 min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對應(yīng)分子質(zhì)量為270.07、150.32、50.97 Da?？梢?，原阿膠低聚肽的分子量分布在50.97 Da～270.07 Da之間。從圖3中可以看出，經(jīng)25%乙醇分離后的阿膠低聚肽溶液中包含4個組分峰，洗脫時間分別出現(xiàn)在 16.379、18.276、19.397、22.241 min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對應(yīng)分子質(zhì)量為1874.85、695.58、387.15、87.56 Da。經(jīng)95%乙醇洗脫后的阿膠低聚肽樣品溶液中主要包括3個組分峰，洗脫時間分別出現(xiàn)在 18.966、20.172、21.379 min，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各峰的對應(yīng)分子質(zhì)量為484.97、258.20、137.39 Da。結(jié)合原阿膠低聚肽的分子量可知，25%乙醇和95%乙醇洗脫后得到的分子量有所增加，脫除了阿膠低聚肽中氨基酸類成分，提高了阿膠低聚肽純度。

2.5 分離前后阿膠低聚肽氨基酸的成分變化

將經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂分離前后的阿膠低聚肽干粉進行氨基酸成分分析，比較分離前后各種氨基酸的含量變化，進一步驗證其脫苦效果，結(jié)果見表5。

表5 不同洗脫組分的氨基酸組成Table 5 Total amino acid composition of desorbed fractions

續(xù)表5 不同洗脫組分的氨基酸組成Continue table 5 Total amino acid composition of desorbed fractions

不同組分親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量見圖4。

圖4 不同組分親水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量Fig.4 Percentage of hydrophilic amino acids and hydrophobic amino acids in different fraction

從圖4可以看出，用95%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時，得到的疏水性氨基酸含量與原樣相比最高，25%乙醇次之，水相最低。馬鐵錚等[14]認(rèn)為疏水性氨基酸的含量與苦味值成正比，疏水性氨基酸的含量越高，苦味值越大。因此，95%乙醇洗脫得到的洗脫液苦味值最大，25%乙醇次之，水相最低。用水相和95%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂時，多數(shù)氨基酸的含量與原樣相比均有明顯變化；25%乙醇洗脫時，除蘇氨酸的含量與原樣相比大幅減少外，其余氨基酸的含量變化均不明顯。因此，用25%乙醇洗脫DA201-C大孔吸附樹脂，能較好的脫除阿膠低聚肽的苦味。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用4種大孔吸附樹脂對阿膠低聚肽進行脫苦研究，并對分離前后的分子量分布和氨基酸組成進行分析。結(jié)果表明：大孔吸附樹脂DA201-C對阿膠低聚肽的脫苦效果優(yōu)于其他3種樹脂，且用體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇作為流動相洗脫時，得到的洗脫液苦味較輕，洗脫率達(dá)到了91.07%。利用HPLC測得分離后阿膠低聚肽中的疏水性氨基酸含量比分離前低，分子量分布在87.56 Da～1874.85 Da之間。該研究為阿膠低聚肽脫苦提供了理論依據(jù)，也為阿膠低聚肽的進一步開發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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