高 媛 ， 鄒小周 ， 洪 楓 ， 陳 琳 *

（1. 纖維材料改性國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東華大學(xué)），上海 201620；2. 東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose, BC）是由微生物產(chǎn)生的超細(xì)納米纖維結(jié)構(gòu)纖維素，因其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)可被廣泛應(yīng)用于造紙、食品、功能材料等領(lǐng)域[1]。作為一種高附加值的生物材料[2]，BC還在人造血管[3]、藥物緩釋[4]、傷口敷料[5]等諸多領(lǐng)域受到研究者的關(guān)注[6]。但BC高成本和低產(chǎn)量限制了其工業(yè)化生產(chǎn)，特別是較高的培養(yǎng)基碳源成本已成為BC工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的主要障礙。近年來(lái)，已有報(bào)道利用工農(nóng)業(yè)原料和廢棄物制備BC的各種嘗試，如利用魔芋[7]、麥稈[8]、稻稈[9-10]、甘蔗糖蜜[11]、紙漿廢料[12]、腰果樹(shù)殘?jiān)黐13]、廢棄棉織物[14]和云杉水解液[15]等。

大豆渣是大豆加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，但由于豆渣所含熱能低且口感粗糙，一直以來(lái)未引起人們的重視。豆渣過(guò)去大多作為家畜飼料或廢棄物傾倒，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[16]。目前豆渣主要的利用方式包括：發(fā)酵制醬油[17]、食品添加劑、提取膳食纖維、提取水解蛋白等[18-19]。豆渣干物質(zhì)中一般含有60～70%的糖類(lèi)[20-21]，這些糖類(lèi)可降解成葡萄糖等可發(fā)酵糖。利用這些糖發(fā)酵制備BC，不僅可以降低BC生產(chǎn)成本，還可以解決廢棄豆渣造成的環(huán)境污染等問(wèn)題。

本文以提取了豆油和蛋白的大豆渣為原料，經(jīng)酸預(yù)水解后再進(jìn)行酶水解，并以預(yù)水解液和酶水解液為碳源分別制備BC，比較兩者在BC產(chǎn)量上的差異，擬開(kāi)發(fā)一種新的低成本培養(yǎng)基碳源。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌體和原料

所用菌種：木葡糖酸醋桿菌DHU-WYZ-1，實(shí)驗(yàn)室篩選菌種；大豆渣由南通來(lái)寶谷物蛋白公司提供，是經(jīng)榨油和提取蛋白后的纖維渣；纖維素酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 工藝流程

1.3 還原糖得率的測(cè)定

還原糖濃度的測(cè)定通過(guò)3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[22]。還原糖得率通過(guò)公式（1）計(jì)算得到。

1.4 纖維素酶活測(cè)定

采用濾紙酶活檢測(cè)法測(cè)定所使用纖維素酶的酶活[23]。濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）的定義：在50℃、pH4.8的條件下，每分鐘由濾紙底物生成2.0 mg葡萄糖所需的酶用量為一個(gè)FPU。

1.5 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.5.1 酸預(yù)處理單因素實(shí)驗(yàn)

研究酸濃度、底物濃度、溫度和時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。1）在底物濃度45 g/L、120℃和反應(yīng)時(shí)間30 min條件下，研究酸濃度在1%～11%范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率影響。2）固定其他條件，酸濃度為5%，研究底物濃度在30～90 g/L范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率影響。3）固定其他條件，設(shè)定反應(yīng)溫度范圍為105～120℃（反應(yīng)器限制，溫度最高只能到129℃），研究溫度對(duì)還原糖得率影響。4）固定其他條件，反應(yīng)時(shí)間15～90 min，研究時(shí)間對(duì)還原糖得率影響。

1.5.2 酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

研究酶濃度、底物濃度、溫度和時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響。1）在底物濃度30 g/L、pH為4.8、50℃條件下，加入纖維素酶130～325 U/mL，恒溫水浴振蕩（100 r/min）8 h，研究酶濃度對(duì)還原糖得率的影響。2）固定其他條件，酶濃度為325 U/mL，研究底物濃度在40～150 g/L范圍內(nèi)對(duì)還原糖得率的影響。3）固定其他條件，設(shè)置溫度為35～60℃，研究溫度對(duì)還原糖得率的影響。4）固定其他條件，反應(yīng)6～30 h，研究時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

1.6 培養(yǎng)基的制備

1.6.1 稀酸預(yù)處理豆渣

底物濃度為60 g/L，酸濃度為5%（w/V），120℃反應(yīng)30 min，冷卻過(guò)濾，濾液保存用于制備BC，濾渣用去離子水洗至pH≥4.5并用凍干機(jī)凍干36 h，得到酶解底物濾渣。

1.6.2 纖維素酶水解濾渣

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.1 g已凍干的濾渣于50 mL容器中，加入19 mL去離子水，調(diào)節(jié)pH為4.8，加入纖維素酶液至反應(yīng)液中纖維素酶的終濃度為325 U/mL，50℃水浴震蕩反應(yīng)24 h，冷卻過(guò)濾，濾液保存用于制備BC。

1.6.3 酸預(yù)水解液和酶水解液的脫毒及培養(yǎng)基制備

1）活性炭脫毒：向水解液中加入2%（w/V）的活性炭，在室溫下劇烈攪拌反應(yīng)5 min后，在9 500 r/min的條件下離心10 min，取出后再進(jìn)行傾濾，取出上清液用10 M的NaOH溶液調(diào)pH至5.0。2）Ca(OH)2脫毒：加入Ca(OH)2調(diào)節(jié)水解液的pH至11.0，在30℃下反應(yīng)3 h，在9 500 r/min的條件下離心10 min，取出上清液后用10 M的H2SO4溶液調(diào)pH至5.0[24]。將不同方式處理后的酸預(yù)水解液和酶水解液測(cè)還原糖濃度，按還原糖添加量為25 g/L配制培養(yǎng)基，并以25 g/L葡萄糖為對(duì)照組，分別加入5 g/L胰蛋白胨和3 g/L酵母粉于121℃，20 min條件下滅菌得木醋桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（如表1所示）。

1.6.4 基本培養(yǎng)基

葡萄糖25 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，pH為5.0，121℃滅菌20 min。

表1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組及所對(duì)應(yīng)的編號(hào)

1.7 菌種培養(yǎng)及細(xì)菌纖維素的制備

從菌種斜面上取一環(huán)木醋桿菌接入含基本培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃，160 r/min的搖床中培養(yǎng)種子液。將培養(yǎng)1 d的種子液以10%（V/V）的接種量接入50 mL錐形瓶中，錐形瓶?jī)?nèi)裝有各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基15 mL。接種后，將錐形瓶置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 d，在液體培養(yǎng)基表面生成細(xì)菌纖維素膜。

1.8 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的測(cè)定

取出培養(yǎng)好的細(xì)菌纖維素膜，經(jīng)蒸餾水多次沖洗后浸入 1%（w/V）的 NaOH溶液中，80℃水浴處理2 h，除去殘存的菌體和培養(yǎng)基，取出后清洗，然后再浸入80℃去離子水中清洗2 h，反復(fù)多次，直至細(xì)菌纖維素膜呈白色半透明狀，再用去離子水反復(fù)沖洗至中性，經(jīng)冷凍干燥36 h后稱(chēng)重。計(jì)算公式（2）如下。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸預(yù)處理和酶水解單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酸或酶等催化劑濃度對(duì)還原糖得率的影響

酸水解反應(yīng)（圖1a）中，還原糖得率隨酸濃度的增加先上升，后趨于平緩。因?yàn)楫?dāng)溫度一定時(shí)，增加酸濃度能促進(jìn)半纖維素和少量纖維素降解生成單糖，繼續(xù)增加酸濃度會(huì)使單糖降解成糠醛和羥甲基糠醛等化合物，造成還原糖得率上升緩慢，所以酸濃取5%較合適。在酶水解反應(yīng)（圖1b）中，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，還原糖得率隨酶濃度的增加先上升，后趨于平緩。說(shuō)明當(dāng)酶濃度達(dá)到一定程度以后，底物與酶的結(jié)合呈飽和狀態(tài)，過(guò)多的酶會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，纖維素酶濃度取325 U/mL較合適。

圖1 催化劑濃度對(duì)還原糖得率的影響

圖2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響

2.1.2 底物濃度對(duì)還原糖得率的影響

酸水解反應(yīng)（圖2a）中，隨著底物濃度的增加，還原糖得率變化不大，而還原糖濃度呈遞增趨勢(shì)。在實(shí)際操作過(guò)程中，底物濃度超過(guò)70 g/L，難以攪拌均勻，體系流動(dòng)性差，底物濃度超過(guò)90 g/L，稀酸溶液不能完全浸濕底物，反應(yīng)物接觸不充分。綜合考慮，底物濃度為60 g/L較合適。在酶水解反應(yīng)（圖2b）中，還原糖得率隨底物濃度的增大逐漸減小，而還原糖濃度先增加后減小。在底物濃度為115 g/L時(shí)，糖濃達(dá)最大值。因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，相對(duì)液量較少，酶解過(guò)程中糖的擴(kuò)散和酶的轉(zhuǎn)移都受到限制，體系不均、流動(dòng)性差，酶解速率降低，還原糖得率降低。綜合考慮，底物濃度選55 g/L較合適。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)還原糖得率的影響

酸水解反應(yīng)（圖3a）中，在所取溫度范圍內(nèi)，還原糖得率逐漸上升，且120℃時(shí)還原糖得率最高。在酶水解反應(yīng)（圖 3b）中，還原糖得率隨溫度的升高，先上升后下降，在 50℃時(shí)，達(dá)最大值。這與纖維素酶的最適反應(yīng)溫度有關(guān)，隨著溫度升高酶催化反應(yīng)速率加快，但超過(guò)最適反應(yīng)溫度后，繼續(xù)升高溫度會(huì)使酶活性降低甚至失活，導(dǎo)致酶解反應(yīng)速率下降，還原糖得率下降。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)還原糖得率的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響

酸水解反應(yīng)（圖4a）中，時(shí)間對(duì)還原糖得率的影響并不明顯，此條件下，反應(yīng)30 min時(shí)還原糖得率最大。在酶水解反應(yīng)（圖4b）中，還原糖得率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，先上升后趨于平緩，可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中的葡萄糖含量和纖維素二糖含量逐漸增加，對(duì)酶水解反應(yīng)起到了一定的抑制作用。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，綜合考慮酸預(yù)處理的適宜條件為：酸濃度為5%，底物濃度為60 g/L，溫度為120℃，時(shí)間為30 min。此條件下，還原糖得率為51.7%。酶水解的適宜條件為：纖維素酶濃度325 U/mL，底物濃度55 g/L，溫度50℃，pH為4.8，時(shí)間24 h。此條件下，還原糖得率為54.5%。

2.2 細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量及分析

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中還原糖濃度的變化

由圖5a可知，以酸預(yù)處理液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組在0～6 d內(nèi)木醋桿菌生長(zhǎng)較快，第6 d開(kāi)始還原糖濃度因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而回升。Ca(OH)2脫毒組在0～12 d內(nèi)還原糖一直在消耗?；钚蕴棵摱窘M在3～9 d內(nèi)耗糖較快。未處理組中木醋桿菌從第6 d開(kāi)始生長(zhǎng)，糖濃在9 d內(nèi)消耗較快。發(fā)酵結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的耗糖量大小依次為對(duì)照組＞Ca(OH)2脫毒組＞活性炭脫毒組＞未處理組。

由圖5b可知，以酶水解液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，Ca(OH)2脫毒組和對(duì)照組的糖濃走向基本一致，前3 d木醋桿菌耗糖較快，后期耗糖較慢。活性炭脫毒組前6 d，糖濃基本不變，從第6 d開(kāi)始耗糖量上升，且耗糖較快。未處理組的耗糖量從第9 d才開(kāi)始上升，前期木醋桿菌基本沒(méi)有生長(zhǎng)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)各實(shí)驗(yàn)組的耗糖量大小依次為對(duì)照組＞Ca(OH)2脫毒組＞活性炭脫毒組＞未處理組。

圖5 各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵過(guò)程中還原糖濃度的變化對(duì)照組活性炭脫毒組未處理組Ca(OH)2脫毒組

圖6 各實(shí)驗(yàn)組純化凍干后的BC產(chǎn)量

2.2.2 細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量

如圖6所示，各實(shí)驗(yàn)組BC產(chǎn)量排序?yàn)镈2（酶解液Ca(OH)2脫毒組）＞C2（酶解液活性炭脫毒組）＞A（葡萄糖對(duì)照組）＞D1（預(yù)處理液Ca(OH)2脫毒組）＞B2（酶解液未處理組）＞C1（預(yù)處理液活性炭脫毒組）＞B1（預(yù)處理液未處理組）。

未經(jīng)脫毒處理的酸預(yù)處理液和酶解液的BC產(chǎn)量都不高，主要原因推測(cè)是預(yù)處理液和酶解液中均含有酸預(yù)處理時(shí)形成的木質(zhì)纖維素衍生抑制物。木質(zhì)纖維類(lèi)原料在高溫、低pH的條件下進(jìn)行預(yù)處理，一般會(huì)生成抑制物[25]。大豆渣中綜纖維素和木質(zhì)素經(jīng)過(guò)稀酸高溫高壓水解誘發(fā)一系列的副反應(yīng)，生成呋喃醛（如糠醛和羥甲基糠酸等）和酚類(lèi)等物質(zhì)，這些物質(zhì)能抑制木醋桿菌生長(zhǎng)代謝，減少BC的產(chǎn)量[26-27]。另外，由于簡(jiǎn)單的水洗不能有效的去除附著在酶解底物濾渣上的抑制物，造成酶解液中還殘留一些抑制物；同時(shí)用活性炭處理的C1和C2兩組，C2的BC產(chǎn)量遠(yuǎn)大于C1，說(shuō)明酸預(yù)處理液中的發(fā)酵抑制物可能遠(yuǎn)多于酶水解液；D1和D2的BC產(chǎn)量分別是酸預(yù)處理液和酶解液發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組中最高的，說(shuō)明Ca(OH)2的脫毒效果優(yōu)于活性炭脫毒，其中D2的BC產(chǎn)量5.52 g/L為最高，是葡萄糖對(duì)照組0.75 g/L的7.4倍，遠(yuǎn)高于對(duì)照組。這可能是因?yàn)槊附庖褐谐擞忻缸饔蒙傻钠咸烟堑忍且酝?，還產(chǎn)生了一些能促進(jìn)木醋桿菌生長(zhǎng)的低聚糖。另外大豆渣是一種天然產(chǎn)物，可能含有一些能夠適應(yīng)木醋桿菌的生長(zhǎng)因子，且酶解底物濾渣中氮元素含量為3.5%（元素分析儀測(cè)得），含氮豐富，有利于BC的合成；C2的BC產(chǎn)量是2.86 g/L，僅次于D2，是葡萄糖對(duì)照組的3.8倍，脫毒效果也較好，其余實(shí)驗(yàn)組的BC產(chǎn)量均低于葡萄糖對(duì)照組；其中，以預(yù)處理液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組BC產(chǎn)量均低于以酶解液作為碳源的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)組，這可能是因?yàn)樗庖褐刑浅煞植町惔笤斐傻?。張碩等實(shí)驗(yàn)分析了七種糖類(lèi)對(duì)木醋桿菌的影響，當(dāng)發(fā)酵初始糖濃為 25 g/L時(shí)，木醋桿菌的BC產(chǎn)量排序依次為D-果糖＞D-葡萄糖＞D-木糖＞D-半乳糖＞L-阿拉伯糖＞D-甘露糖[28]，酸預(yù)處理過(guò)程水解的主要是半纖維素，降解后主要生成L-阿拉伯糖、木糖和半乳糖，預(yù)處理液中葡萄糖含量較少，而酶解液中的糖成分主要是葡萄糖。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以酶解液作為發(fā)酵碳源時(shí)，Ca(OH)2脫毒后的BC產(chǎn)量是葡萄糖對(duì)照組的7.4倍，說(shuō)明以大豆渣作為發(fā)酵碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的效果明顯優(yōu)于以葡萄糖為碳源的，能有效降低BC生產(chǎn)成本，提高原料利用率。對(duì)比酶水解得到的碳源，雖然酸預(yù)處理液實(shí)驗(yàn)組的BC產(chǎn)量普遍偏低，但是作為豆渣原料的預(yù)處理工序，也產(chǎn)生了一定量的可發(fā)酵糖，提高了原料利用率。就兩種脫毒方法而言，Ca(OH)2脫毒法優(yōu)于活性炭脫毒。這與郭香在云杉水解液脫毒工作中得到的結(jié)果相同，說(shuō)明Ca(OH)2脫毒相對(duì)于其它方法普遍有效[15]。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了酸或酶的催化劑濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)酸預(yù)處理和酶水解反應(yīng)的影響，研究比較了以葡萄糖、酸預(yù)處理液、酶解液作為碳源制備BC的產(chǎn)量。結(jié)果表明：用Ca(OH)2脫毒后的酶解液作為碳源，獲得的BC產(chǎn)量5.52 g/L最高，是對(duì)照組0.75 g/L的7.4倍，明顯優(yōu)于葡萄糖對(duì)照組。大豆渣價(jià)廉量大，稀酸預(yù)處理、酶水解過(guò)程操作簡(jiǎn)單，所以大豆渣是制備細(xì)菌纖維素的良好碳源，這為細(xì)菌纖維素的工業(yè)化低成本規(guī)模生產(chǎn)提供了一條新的路徑。

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