劉 最， 何麗芳， 陳曉華， 滕 濤， 李玉中*

（衡陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，湖南 衡陽 421008）

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，年產(chǎn)農(nóng)作物秸稈約5.7億噸以上，占世界秸稈總產(chǎn)量的20%～30%[1]。因此，秸稈是我國(guó)極為豐富的可再生資源。在水稻產(chǎn)區(qū)，稻草秸稈占農(nóng)作物秸稈的絕大部分。秸稈還田技術(shù)是當(dāng)今世界范疇內(nèi)改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境、發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、促進(jìn)綠色食品產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施[2]。但秸稈在自然狀態(tài)下降解緩慢，阻礙了這一措施的推廣和實(shí)施。目前絕大部分稻草秸稈仍然被焚燒，不僅對(duì)環(huán)境造成了一定的污染[3]，同時(shí)也存在一定的安全隱患。另外，由于秸稈的焚燒導(dǎo)致土壤營(yíng)養(yǎng)成分的丟失，使用額外的化學(xué)肥料或農(nóng)家肥料來補(bǔ)充，從而造成更為嚴(yán)重的二次大氣污染[4]。

因此，如何快速降解秸稈成為解決秸稈還田的關(guān)鍵。秸稈降解緩慢的主要原因是其內(nèi)含有大量的纖維素，纖維素的降解速度決定了秸稈還田的速度[5]。目前，關(guān)于纖維素降解的方法常見的有化學(xué)降解法、物理降解法和生物降解法。而生物降解法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如安全環(huán)保、降解速率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因而，纖維素降解菌的分離、篩選和酶活性的測(cè)定成為當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)[6-10]。

為了加速秸稈還田，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展，有必要篩選稻田纖維素降解微生物，以期用于稻田秸稈的還田。同時(shí)，解決當(dāng)前慣用的焚燒法處理稻草秸稈所造成的環(huán)境污染問題。目前，國(guó)內(nèi)外分離篩選出的纖維素降解真菌主要集中在木霉屬、青霉屬、曲霉屬、根霉屬、漆斑霉屬等絲狀真菌[11]，但關(guān)于冬克青霉降解纖維素的研究還未見報(bào)道。并且關(guān)于該菌株的相關(guān)研究報(bào)道少，《中國(guó)真菌志》記載冬克青霉為罕見菌種，不易分離，在我國(guó)上海和湖北神農(nóng)架鮮有分布[12]。

本文從富含纖維素的土壤中采集土壤樣本，分離和篩選纖維素降解菌株，為高效處理農(nóng)作物秸稈等纖維素資源及秸稈快速還田提供新資源。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 樣本

在衡陽市郊區(qū)及祁東縣采集稻田土壤樣本，并編號(hào)，實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)及采集地點(diǎn)如表1所示。

表1 樣本采集信息

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（濾紙條液體培養(yǎng)基）：(NH4)2SO43.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，KH2PO41.0 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.001 7 g，CaCl20.1 g，CoCl20.002 g，NaCl 0.1 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值6.5。

篩選培養(yǎng)基（剛果紅纖維素瓊脂）[11]：KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，瓊脂14 g，明膠2 g，纖維素粉1.88 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂粉20 g，水1 000 mL，自然pH。

種子培養(yǎng)基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏10.0 g，KH2PO42.0 g，(NH4)2SO41.5 g，蒸餾水1 000 mL。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，蛋白胨3 g，牛肉膏1 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。查氏酵母膏瓊脂（CYA）[12]：

1）查氏濃儲(chǔ)液備用：NaNO330 g，KCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水 100 mL。

2）CYA配方：K2HPO41.0 g，查氏濃儲(chǔ)液10 mL，酵母膏5 g，蔗糖30 g，瓊脂15 g，水1 000 mL。

稻草固體培養(yǎng)基：將稻草秸稈剪成約1 cm的小片段，用自來水洗滌后進(jìn)行40目的過篩處理，隨后將其置于鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，進(jìn)行壓制處理后均等分裝于潔凈的廣口培養(yǎng)瓶中（每瓶3 g），再分別加入12 mL的水。蓋上蓋子濕熱滅菌。

1.2 方法

1.2.1 菌株富集培養(yǎng)及分離

稱取采集的各樣本5 g，加至裝有無菌玻璃珠的三角錐形瓶中，加入50 mL無菌水充分混合均勻，搖床充分振蕩20 min，用滅菌紗布過濾，靜置1 h，取上清液 1 mL接種于富集培養(yǎng)基中，220 r/min、28℃培養(yǎng) 5～7 d，使纖維素降解菌富集，并觀察記錄濾紙條的降解情況。取濾紙條降解的樣品懸浮液各 0.1 mL，分別涂布接種到加有0.01%青霉素和0.01%農(nóng)用硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，25～26℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行純化保藏。

1.2.2 纖維素降解菌株的篩選

將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基中，每皿3點(diǎn)，30℃培養(yǎng)4 d。若該菌產(chǎn)生纖維素酶，菌落周圍則會(huì)出現(xiàn)透明圈，用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑（d, mm）和透明圈直徑（D, mm），依據(jù)D/d值大小來選擇產(chǎn)酶菌株，選取比值大的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

采用三點(diǎn)接種法和插片法將菌株1-4接種到鑒定培養(yǎng)基（CYA）上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，觀察菌落的形態(tài)，顯微鏡下觀察菌絲大小、孢子梗及孢子等形態(tài)，參閱《中國(guó)真菌志》[12]描述進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.2.4 菌株1-4 FPAase的測(cè)定

粗酶液制備：將菌株1-4接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)3 d，取2 mL接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中。30℃，180 r/min培養(yǎng)4 d，吸取8 mL發(fā)酵液，4℃條件下4 000 r/min離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

濾紙?zhí)幚恚菏褂们皩⑵溆?%的醋酸溶液浸泡24 h以除去淀粉，用碘液檢驗(yàn)，再用2%的NaHCO3溶液洗至中性，曬干。

酶活測(cè)定：根據(jù)DNS（3,5-二硝基水楊酸）比色法測(cè)定總纖維素酶活力即濾紙酶活（FPAase）[13-14]。將50 mg經(jīng)預(yù)處理的定性濾紙放入25 mL比色管中，加入1 mL粗酶液，加1 mL CMC-Na的檸檬酸緩沖液（pH值5），以不加粗酶液反應(yīng)作為空白對(duì)照，50℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min，加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷卻停止反應(yīng)，定容至10 mL，于540 nm波長(zhǎng)測(cè)定其OD值。在上述測(cè)定條件下，每分鐘1 mL酶液催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，用U/mL表示[15]。

1.2.5 菌株1-4對(duì)稻草的降解效果

用無菌生理鹽水洗脫下PDA上培養(yǎng)7 d的青霉1-4的孢子，將孢子配制成5×106個(gè)/mL濃度的懸浮液。取3 mL青霉1-4孢子懸浮液加入到滅菌稻草固體培養(yǎng)基。以加3 mL無菌水為對(duì)照。接種后28℃恒溫培養(yǎng)，在培養(yǎng)7 d、14 d和21 d時(shí)，分別取3瓶觀察稻草降解情況并按照薛惠琴等人[16]的方法測(cè)定稻草中纖維素的含量。在21 d時(shí)，取少許稻草秸稈用乳酸酚棉蘭染液對(duì)其進(jìn)行染色處理，在顯微鏡下觀察稻草秸稈中菌株的生長(zhǎng)及分布情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素降解菌株的分離與初篩

富集培養(yǎng)6 d后，6組樣本中的4組濾紙條有明顯的崩解現(xiàn)象，從這4組中用涂布平板法共分離得到16株具有纖維素降解活性的真菌菌株。（詳見表2）。

表2 各類土樣中降解菌株的分離情況

2.2 纖維素降解菌株的復(fù)篩

剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)接的16株純化真菌，從第 3 d 起菌落周圍開始出現(xiàn)透明圈，編號(hào)為1-4、6-2、6-3的 3 株菌透明圈較為明顯。其中，菌株1-4的菌落較小，生長(zhǎng)規(guī)整、圓形，透明圈最為明顯和清晰，其透明圈和菌落直徑比值最大，為1.22（表3）。菌株6-2、6-3菌落生長(zhǎng)不規(guī)則，其菌落周圍有一定的透明帶，但帶很窄（圖1）。從以上結(jié)果看，菌株1-4為分離到的降解纖維素能力最強(qiáng)的菌。

表3 篩選所得菌株透明圈與菌落直徑

圖1 3株復(fù)篩菌株在纖維素剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈

2.3 菌株1-4的形態(tài)鑒定結(jié)果

菌株1-4在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d后菌落形態(tài)呈圓形絮狀，中心臍狀突起邊緣整齊，初期為灰綠色，粉末狀（圖 2a）。在查氏酵母膏固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈放射狀或有臍狀突起；質(zhì)地絨狀，初期呈白色，后期顏色轉(zhuǎn)暗（圖2b）。

圖2 菌株1-4的形態(tài)學(xué)特征

菌株?duì)I養(yǎng)菌絲體無色、有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔。其生于基質(zhì)或氣生菌絲，孢子梗(40～70)－(200～250)×(2.0～3.0) μm，壁平滑，帚裝分枝頂端具有膨大的頂囊，達(dá)4.5 μm；帚狀枝單輪生，偶有?；鶢罘种Γ黄抗Ｃ枯?～12個(gè)，8.0～10.5×2.2～3.0 μm（圖2c）；在400倍顯微鏡下觀察到該菌株的分生孢子近球形或球形，直徑2～2.5 μm，壁光滑；分生孢子鏈呈現(xiàn)較疏松的圓柱狀（圖2d）。經(jīng)形態(tài)鑒定，該菌株為類曲霉亞屬的冬克青霉（Penicillium donkii）。目前關(guān)于該菌株的相關(guān)研究報(bào)道少，《中國(guó)真菌志》記載冬克青霉為罕見菌種，不易分離，在我國(guó)上海和湖北神農(nóng)架鮮有分布[12]。

2.4 菌株1-4 的FPAase

液體發(fā)酵培養(yǎng) 5 d后菌株 1-4的 FPAase為 11.2 U/mL，之后酶活力隨著發(fā)酵天數(shù)延長(zhǎng)而增大，在第8 d天，酶活最大為15.0 U/mL，之后又開始減?。ㄈ鐖D3所示）。可作為一株具有潛力的纖維素降解菌。但要用于工業(yè)生產(chǎn)須對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，理化性質(zhì)進(jìn)行深入研究，以獲得更高的纖維素降解能力，以進(jìn)一步提高其利用價(jià)值，對(duì)實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株1-4總纖維素酶活性的影響

2.5 菌株降解稻草效果

經(jīng)觀察，培養(yǎng)7 d后，有少量的菌苔多生長(zhǎng)于稻草秸稈兩端的切口處，中間部位幾乎未見菌株生長(zhǎng)。培養(yǎng)到14 d時(shí)，菌株的生長(zhǎng)情況明顯較第一周茂盛，而且菌落的顏色明顯有所加深。除了秸稈切口處生長(zhǎng)有濃密的菌落外，其中間部位也可見少量菌落生長(zhǎng)。培養(yǎng)到21 d時(shí)，秸稈中間部位也生有較多的菌落。加入無菌水的對(duì)照組的稻草培養(yǎng)基中無明顯的變化。（圖4a～4d）。

經(jīng)染色后在 10×40倍顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌株大多生長(zhǎng)于稻草秸稈端部的切口處，中間部位則分布有繁密的且雜亂的纖細(xì)菌絲體。菌株的染色較淺，分生孢子梗頸較短小，孢子梗上殘留的孢子穗數(shù)量也較少。（圖 4e、4f）

圖4 菌株1-4在稻草秸稈上的生長(zhǎng)情況

連續(xù)培養(yǎng)21 d后，對(duì)照中的纖維素含量由30.3%變?yōu)?9.91%，而接種菌株1-4的處理中稻草纖維素含量由接種前的30.3%減少至26.36%（如圖5所示）。說明菌株1-4對(duì)稻草秸稈中的纖維素具有一定的降解能力。研究發(fā)現(xiàn)，菌落多出現(xiàn)在稻草秸稈的切口處。依據(jù)此特點(diǎn)，在秸稈還田中，可將稻草秸稈處理的更碎以產(chǎn)生更多的切口，以利于菌株更好地生長(zhǎng)，加快秸稈的降解。同時(shí)也可人為的培養(yǎng)該菌，將其和秸稈混施入土壤，提高菌量加快秸稈的降解速度。

3 結(jié)論

圖5 稻草培養(yǎng)基中纖維素含量與發(fā)酵時(shí)間關(guān)系圖

本研究以篩選纖維素降解菌，加速秸稈還田為目的，從富含纖維素的樣本中分離出16 株真菌，通過纖維素剛果紅平板法復(fù)篩獲得3株可產(chǎn)生較明顯透明圈的真菌菌株（編號(hào)為1-4、6-2、6-3）。依據(jù)D/d值大小來選擇最終確定菌株1-4為最具纖維素降解能力的菌株，觀察菌株1-4在PDA和CYA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征和菌體顯微結(jié)構(gòu)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為冬克青霉（Penicillium donkii），該菌為類曲霉亞屬真菌。該菌在28℃，180 r/min生長(zhǎng)第8 d時(shí)出現(xiàn)最高值，其總纖維素酶活為15.0 U/mL，該菌對(duì)稻草秸稈中纖維素的降解有一定的促進(jìn)作用。

[1]張加春, 易琴, 黃遵錫. 纖維素酶曲的淺盤生產(chǎn)研究[J]. 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）, 2002, 20(2): 50-52.

[2]路文濤, 賈志寬, 張鵬, 等. 秸稈還田對(duì)寧南旱作農(nóng)田土壤活性有機(jī)碳及酶活性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,30(3): 522-528.

[3]卞有生. 生態(tài)農(nóng)業(yè)中廢棄物的處理與再生利用（第2版）[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 300-331.

[4] Lelieveld J, Evans J S, Fnais M, et al. The contribution of outdoor air pollution sources to premature mortality on a global scale[J]. Nature, 2015, 525(7569): 367-371.

[5]李大婧, 劉春泉, 王振宇. 纖維素酶及其在天然產(chǎn)物開發(fā)中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33(6): 140-142.

[6]韋曉菊, 黎繼烈, 張蕾, 等. 青霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(9): 125-130.

[7]王洪媛, 范丙全. 三株高效秸稈纖維素降解真菌的篩選及其降解效果[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2010, 50(7): 870-875.

[8]殷中偉, 范丙全, 任萍. 纖維素降解真菌Y5的篩選及其對(duì)小麥秸稈降解效果[J]. 環(huán)境科學(xué), 2011, 32(1): 247-252.

[9]黃寧珍, 付傳明, 何金祥, 等. 纖維素降解真菌分離篩選、產(chǎn)酶特性及高效水解菌系的初步構(gòu)建[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010,23(5): 1489-1496.

[10]李悅, 薛橋麗, 李世俊, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化小刺青霉16-7產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵工藝[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(17): 137-145.

[11]王淑軍, 楊從發(fā), 陳靜. 用于降解秸稈的纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2001, 12: 21-23.

[12]孔華忠. 中國(guó)真菌志: 第三十五卷（青霉屬及其相關(guān)有性型屬）[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 54-56.

[13] Coward-Kelly G, Aiello-Mazzari C, Kim S, et al. Suggested improvements to the standard filter paper assay used to measure cellulase activity[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82(6): 745-749.

[14]許玉林, 鄭月霞, 葉冰瑩, 等. 一株纖維素降解真菌的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2013, 40(2): 220-227.

[15]林金秀. 纖維素降解菌的篩選及其發(fā)酵條件研究[D]. 福建農(nóng)林大學(xué), 2010.

[16]薛惠琴, 杭怡瓊, 陳誼. 稻草秸稈中木質(zhì)素、纖維素測(cè)定方法的研討[N]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2001, 46(2): 15.

[17]熊冬梅, 周紅麗. 纖維素降解菌群的研究進(jìn)展[J]. 釀酒科技, 2011, 32(5): 94-97.