錢 怡，楊 敏，林凡莉，汪姝玥，李曉明，黃純蘭

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，四川瀘州 646000)

造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cells，HSCs)存在于造血組織，具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，是所有成熟血細(xì)胞的前體細(xì)胞。造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治療惡性血液病、遺傳性疾病及免疫缺陷病的重要手段之一。骨髓微環(huán)境對于HSCs的增殖、分化、遷移及歸巢等具有重要的調(diào)控作用[1]。HSCT并非僅僅是單純的HSCs輸注，還包括骨髓基質(zhì)細(xì)胞和其他造血調(diào)節(jié)因子的同時(shí)輸注，以便更好、更快地重塑造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。然而，人骨髓中HSCs比例較低，極大地限制了HSCT的發(fā)展和臨床應(yīng)用。本文通過研究微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MECs)對HSCs增殖的影響，建立一種促進(jìn)HSCs增殖的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體質(zhì)量20～25 g，4～6周齡，雄性或雌性，無特殊病原體(SPF)級C57BL/6小鼠(購自成都達(dá)碩生物科技有限公司)和C57系GFP小鼠(購自重慶騰鑫生物公司)。

1.1.2主要儀器與試劑 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)，超凈工作臺(Air Tech公司)，臺式離心機(jī)(Bioridge公司)，倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，質(zhì)譜(MS)分離柱、mini MACS磁珠分選裝置、CD117細(xì)胞分選試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素(IL)-3、小鼠干細(xì)胞因子(SCF)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的兔抗鼠CD31(CD31-FITC)及藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的CD117(CD117-APC)購自Miltenyi Biotec公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)購自ACRO公司，Ⅰ型膠原酶、明膠粉購自Sigma公司，藻紅蛋白標(biāo)記的兔抗鼠CD34(CD34-PE)及多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)標(biāo)記的CD45(CD45-PerCP)購自BD公司，羊抗八因子相關(guān)抗原(vWF)多克隆抗體、FITC標(biāo)記的驢抗羊IgG(IgG-FITC)購自Abcam公司，F(xiàn)icoll分離液購自TBD公司，DMEM-F12購自南京三生生物公司。

1.2方法

1.2.1MECs分離、培養(yǎng)及鑒定

1.2.1.1MECs的培養(yǎng) MECs使用添加有20%胎牛血清(FBS)、2 ng/mL VEGF、100 U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及鏈霉素的DMEM-F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.2MECs的分離與培養(yǎng) 頸髓離斷處死小鼠，75%乙醇浸泡約5 min。逐層剪開胸腔，剝離肺組織外的臟層胸膜，剪取肺葉組織，除掉可見的支氣管和大血管。剪碎肺組織至1 mm左右，裝入離心管。加入與組織等量的含2%牛血清蛋白(BSA)和0.1%Ⅰ型膠原酶的消化液，吹打混勻，37 ℃搖床消化。每5分鐘吹打1次，共消化約30 min。加入FBS和DMEM-F12終止消化，過200目濾網(wǎng)。300×g離心10 min，棄上清液。加入DMEM-F12重懸，400×g離心10 min，棄上清液，用DMEM-F12完全培養(yǎng)基重懸。經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定。以1×106個(gè)/cm2密度接種于0.1%明膠包被的24孔板，置于37 ℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行首次全量換液，此后每2～3天換1次，逐日顯微鏡下觀察。0.25%胰蛋白酶消化“鋪路石”樣貼壁細(xì)胞用于流式細(xì)胞儀(FCM)鑒定和共培養(yǎng)。

1.2.1.3免疫熒光鑒定 第8天24孔板中的細(xì)胞2孔，設(shè)對照孔、實(shí)驗(yàn)孔，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加4%多聚甲醛200 μL，室溫固定15 min。去掉多聚甲醛，PBS洗滌2次，加入5% BSA封閉30 min。實(shí)驗(yàn)孔加5 μL CD31-FITC和45 μL PBS，對照孔加50 μL PBS，4 ℃冰箱避光孵育10 min。PBS洗滌后加100 μL 0.2% Triton X-100溶液，混勻，5 min后PBS洗滌。加入5 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和100 μL PBS，混勻，避光孵育3 min，PBS洗滌。熒光顯微鏡下觀察采圖，隨機(jī)選取3個(gè)視野(×200)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

1.2.1.4流式鑒定 設(shè)對照管、實(shí)驗(yàn)管1、實(shí)驗(yàn)管2、實(shí)驗(yàn)管3，均加上述制備的細(xì)胞懸液200 μL(細(xì)胞數(shù)大于1×105個(gè))。對照管加IgG-FITC、IgG-PE、IgG-PerCP各5 μL，實(shí)驗(yàn)管1加5 μL CD31-FITC，實(shí)驗(yàn)管2加5 μL CD34-PE，實(shí)驗(yàn)管3加5 μL CD45-PerCP，混勻，4 ℃避光孵育15 min。PBS洗滌，200×g離心5 min，去上清液。400 μL PBS重懸上機(jī)檢測。

1.2.1.5vWF-FITC 流式鑒定 設(shè)置對照管、實(shí)驗(yàn)管，均加備用細(xì)胞懸液200 μL。離心后加200 μL 0.4%多聚甲醛重懸，室溫下固定20 min，PBS洗滌離心后加200 μL 0.2%皂素溶液重懸，靜置20 min，PBS洗滌離心。200 μL PBS混勻細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)管加4 μL羊抗vWF多克隆抗體，對照管加4 μL羊IgG，室溫孵育30 min。PBS洗滌離心后200 μL PBS重懸，加4 μL驢抗羊IgG-FITC，室溫避光孵育20 min。洗滌，400 μL PBS重懸上機(jī)檢測。

1.2.2GFP小鼠骨髓HSCs的分離、鑒定

1.2.2.1密度梯度離心與磁珠分選 頸椎脫臼法處死小鼠，置于75%乙醇中浸泡約5 min。逆向解剖法剝離股骨、脛骨，PBS沖洗。剪去骨端約2 mm，暴露髓腔。1 mL注射器插入骨髓腔，用PBS反復(fù)沖洗髓腔至發(fā)白，沖出的骨髓收集于離心管，過200目濾網(wǎng)。離心去上清液，加1 mL PBS重懸，混勻。加2 mL復(fù)溫的Ficoll分離液(1.084 g/mL)于離心管，加樣槍沿管壁緩慢加入上述細(xì)胞懸液。20 ℃ 400×g離心30 min。收集中間云霧層(即單個(gè)核細(xì)胞層)，以1∶3比例加入PBS稀釋，制成細(xì)胞懸液，400×g離心10 min，棄上清液，重復(fù)1次。經(jīng)活力測定及計(jì)數(shù)。加入預(yù)冷Buffer[0.5% BSA、2 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS]3 mL，吹打混勻，22 ℃ 300×g離心10 min，棄上清液。按照每1×108個(gè)MNCs用80 μL預(yù)冷Buffer重懸，每1×107個(gè)MNCs加20 μL CD117微珠標(biāo)記細(xì)胞，混勻，4 ℃冰箱避光孵育15 min。每1×107個(gè)MNCs用1 mL Buffer洗滌，300×g離心10 min，去上清液，每1×108個(gè)MNCs加入500 μL Buffer重懸。連接MACS分選裝置，500 μL Buffer潤濕MS柱，骨髓細(xì)胞懸液滴入MS柱，收集洗脫細(xì)胞。Buffer沖洗MS柱3次，每次500 μL。MS柱移出磁場，加1 mL Buffer，配備活塞加壓快速推出滯留在MS柱內(nèi)的標(biāo)記細(xì)胞，離心管收集。對CD117+細(xì)胞進(jìn)行活力測定并計(jì)數(shù)，留作流式純度鑒定和共培養(yǎng)使用。

1.2.2.2FCM檢測CD117+細(xì)胞純度及CD117 CD34表達(dá)率 設(shè)置對照管、實(shí)驗(yàn)管1和2。對照管加MNCs懸液200 μL、IgG-APC和IgG-PE各5 μL，實(shí)驗(yàn)管1和2均加分選后的陽性細(xì)胞懸液200 μL和5 μL CD117-APC，實(shí)驗(yàn)管2再加CD34-PE 5 μL，混勻，4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗滌離心，加400 μL PBS重懸上機(jī)檢測。

1.2.3MECs促進(jìn)HSCs增殖

1.2.3.1HSCs培養(yǎng)基 添加有20% FBS、25 ng/mL SCF、25 ng/mL IL-3、0.1 mg/mL青霉素及鏈霉素的DMEM-F12完全培養(yǎng)基。

1.2.3.2分組 (1)對照組：HSCs單培養(yǎng)；(2)共培養(yǎng)組：HSCs+MECs。

1.2.3.3細(xì)胞準(zhǔn)備 (1)MECs：“鋪路石”的MECs經(jīng)胰酶消化后，收集入離心管，PBS洗滌離心。MECs培養(yǎng)基重懸，密度為5.0×104個(gè)/mL。(2)HSCs：MACS收獲的HSCs，PBS洗滌離心。HSCs培養(yǎng)基重懸，密度為5.0×104個(gè)/mL。

1.2.3.4種板與換液 (1)共培養(yǎng)組：MECs接種于24孔板，每孔200 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、95%濕度孵箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后去掉培養(yǎng)基每個(gè)復(fù)孔均加HSCs懸液200 μL、HSCs培養(yǎng)基300 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。(2)對照組：24孔板，每孔HSCs懸液200 μL、HSCs培養(yǎng)基300 μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2、95%濕度孵箱中培養(yǎng)。每3天半量換液，培養(yǎng)7 d。

1.2.3.5熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡下觀察生長情況，每天取3個(gè)復(fù)孔懸浮細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。

1.2.3.6FCM檢測共培養(yǎng)組擴(kuò)增后CD117 CD34表達(dá)率 收集MECs組3個(gè)復(fù)孔HSCs，PBS洗滌離心，400 μL PBS重懸，一式兩份，1份加IgG-APC、IgG-PE各5 μL，混勻，作同型對照；另1份加CD117-APC、CD34-PE各5 μL，混勻。4 ℃冰箱避光孵育30 min，PBS洗滌離心，400 μL PBS重懸上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1MECs分離、培養(yǎng)、鑒定

2.1.1MECs原代培養(yǎng) 接種后6 h見貼壁細(xì)胞，第3天細(xì)胞聚集生長，形成形態(tài)大小較一致的細(xì)胞簇，第6天相鄰細(xì)胞突起彼此相連，成“血管樣”改變，第14天達(dá)80%融合，呈“鋪路石”外觀，見圖1。

2.1.2CD31免疫熒光鑒定 熒光顯微鏡下，細(xì)胞呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，見圖2；培養(yǎng)第8天陽性細(xì)胞百分率為54.5%。

2.1.3MECs流式鑒定 vWF、CD31、CD34、CD45的陽性率分別為81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，見圖3。

2.2GFP小鼠骨髓HSCs分離、鑒定

2.2.1骨髓HSCs分離 骨髓經(jīng)密度梯度離心后分4層，中間的云霧層即為MNCs。平均每只小鼠骨髓可獲得約1.1×108個(gè)MNCs，活細(xì)胞率為98%。

2.2.2CD117+細(xì)胞回收及純度 每只小鼠MNCs經(jīng)MACS分選后可獲約4.7×105個(gè)CD117+細(xì)胞，活細(xì)胞率為97%，純度為99.51%，見圖4。

圖1 MECs原代培養(yǎng)(×40)

A：DAPI染色圖；B：CD31抗體染色圖；C：A、B合成圖

圖2 CD31抗體免疫熒光鑒定(×200)

圖3 流式檢測MECs 的vWF、CD31、CD34、CD45表達(dá)

圖4 MACS分選后的CD117+細(xì)胞純度分析

2.3MECs促HSCs增殖

2.3.1對照組和共培養(yǎng)組細(xì)胞擴(kuò)增變化 共培養(yǎng)第0天，兩組HSCs計(jì)數(shù)均為1.00×104個(gè)；共培養(yǎng)第7天，對照組、共培養(yǎng)組HSCs計(jì)數(shù)分別為6.92×104、12.31×104個(gè)，見表1。熒光顯微鏡下觀察HSCs生長情況：共培養(yǎng)第2、4、6、7天，共培養(yǎng)組綠色熒光細(xì)胞多于對照組，見圖5。第1～7天，共培養(yǎng)組與對照組細(xì)胞計(jì)數(shù)的相對變化倍數(shù)分別為1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78，兩組細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1；第4天變化最明顯，見圖6。對照組第1～7天較第0天的HSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：第1天擴(kuò)增0.99倍(P>0.05)，第2～7天擴(kuò)增倍數(shù)分別為1.42、2.30、4.25、5.66、6.45、6.92(P<0.05)。共培養(yǎng)組第1～7天較第0天的HSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：第1～7天擴(kuò)增倍數(shù)分別為1.20、1.92、3.45、7.31、9.72、11.28、12.31(P<0.05)。

2.3.2共培養(yǎng)組共培養(yǎng)前后HSCs CD117 CD34共表達(dá)率變化 共培養(yǎng)前HSCs CD117 CD34共表達(dá)率為75.85%，見圖7。共培養(yǎng)后HSCs CD117 CD34共表達(dá)率為92.06%，見圖8。共培養(yǎng)7天后，共培養(yǎng)組HSCs CD117 CD34共表達(dá)率增加。

圖5 熒光顯微鏡下觀察HSCs生長情況(×100)

圖6 共培養(yǎng)組與對照組HSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)的相對變化

圖7 共培養(yǎng)前HSCs D117 CD34共表達(dá)率流式檢測

組別第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天對照組 1.000.99±0.03 1.42±0.022.30±0.064.25±0.205.66±0.126.45±0.14 6.92±0.17共培養(yǎng)組 1.00 1.20±0.04* 1.92±0.45*3.45±0.09*7.31±0.06*9.72±0.12*11.28±0.12*12.31±0.11*

注：**P<0.05，與對照組比較

圖8 共培養(yǎng)后HSCs CD117 CD34共表達(dá)率流式檢測

3 討 論

骨髓龕按照骨髓解剖部位和功能作用差異分為兩類：以成骨細(xì)胞為主的成骨龕，以內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)為主的血管龕[2]。前者維持HSCs的穩(wěn)態(tài)，后者調(diào)控HSC增殖、分化、動(dòng)員及歸巢[3]。然而不同組織來源的ECs生物學(xué)特性存在差異。MECs存在于毛細(xì)血管、微靜脈及微動(dòng)脈，肺組織含量最多[4]，取材簡便，因此作為本實(shí)驗(yàn)ECs來源。目前ECs鑒定方法主要有3種：細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞抗原標(biāo)記、細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)。W-P小體是代表性的ECs細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)，但是該小體會(huì)因種屬、部位、培養(yǎng)條件、細(xì)胞狀態(tài)的差異而呈現(xiàn)不同的形狀和結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)概率極低[5-7]。故本實(shí)驗(yàn)選用前兩種方法鑒定ECs。CD31、CD34、vWF是ECs鑒定較為理想的抗原標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化的細(xì)胞在培養(yǎng)第6天細(xì)胞突起彼此相連，成血管樣改變，第14天長至80%融合，呈“鋪路石”樣。培養(yǎng)第8天的細(xì)胞CD31熒光檢測陽性率為54.5%。第14天細(xì)胞流式檢測vWF、CD31、CD34、CD45的陽性率分別為81.39%、45.80%、57.48%、0.17%，符合文獻(xiàn)報(bào)道[8]。故本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)出肺MECs。

HSCs主要存在于骨髓龕，目前骨髓分離HSCs的方法主要有免疫磁珠分選和流式細(xì)胞分選。免疫磁珠分選法操作簡便、快速，MACs分離純度高達(dá)99%，細(xì)胞損傷小，可直接用于培養(yǎng)研究和流式檢測。CD117即SCF受體，主要表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)選用CD117作為分選小鼠HSCs免疫標(biāo)記。每只小鼠骨髓經(jīng)CD117磁珠分選后可收獲4.7×105個(gè)陽性細(xì)胞，純度為99.51%，成功分選出骨髓HSCs。

共同起源學(xué)說認(rèn)為血管ECs與早期HSCs都是由胚胎卵黃囊血島細(xì)胞分化而來[9]。激活小鼠ECs中的蛋白激酶B1(AKT1)，不僅可以擴(kuò)增HSCs，還能重建輻射小鼠的造血系統(tǒng)[10]。腦MECs通過胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)功能性克隆促進(jìn)CD34+CD38-HSCs體外增殖[11]。MECs能促進(jìn)損傷后HSCs的保持和更新[12]。ECs作為臍血細(xì)胞的滋養(yǎng)層，可明顯增加擴(kuò)增CD34+CD38-細(xì)胞數(shù)量[13]。綜上研究，ECs會(huì)調(diào)控HSC增殖、分化、歸巢。本研究發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)過程中：(1)培養(yǎng)時(shí)間增加，兩組HSCs數(shù)量均增加，MECs組較對照組增加更明顯。(2)第1～7天均與第0天對比，共培養(yǎng)組及對照組HSCs均擴(kuò)增，且共培養(yǎng)組擴(kuò)增倍數(shù)大于對照組，第4天MECs促進(jìn)HSCs增殖的作用最明顯。由此可見，MECs促進(jìn)HSCs增殖，且第4天最明顯。

綜上所述，共培養(yǎng)第7天的共培養(yǎng)組懸浮細(xì)胞HSCs CD117 CD34共表達(dá)率增加，而既往研究發(fā)現(xiàn)小鼠年齡和狀態(tài)會(huì)影響HSCs CD34抗原表達(dá)。5周齡以下的小鼠，包括胚胎期、新生小鼠，所有的HSCs都表達(dá)CD34，7周齡小鼠有CD34-的HSCs，10～20周齡大多數(shù)HSCs不表達(dá)CD34[14]。小鼠CD34+HSCs與CD34-HSCs可以相互轉(zhuǎn)化，活化狀態(tài)下的HSCs表達(dá)CD34[15]，人HSCs CD34抗原表達(dá)是可逆的[16]。4～6周齡小鼠HSCs分為CD34+和CD34-群[17]。筆者認(rèn)為MECs可以促進(jìn)HSCs CD34表達(dá)，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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