王春芳 雷茗 龐曉霞 黃華佗 王俊利 韋貴將 韋葉生

【摘要】目的分析miR181基因rs16927589位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在中國(guó)廣西地區(qū)人群中的分布特點(diǎn)，并比較其基因型和等位基因頻率與其他種族和地區(qū)人群間的分布差異。方法采用SNaPshot SNP技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)299例中國(guó)廣西人群rs16927589位點(diǎn)SNPs，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其基因型和等位基因頻率與國(guó)際人類(lèi)基因組單體型圖（Haplotype map，HapMap）計(jì)劃公布的北京人群（HapMapHCB）、日本人群（HapMapJPT）、肯尼亞人群（HapMapLWK）、印度人群（HapMapGIH）及歐洲人群（HapMapCEU）間的差異。結(jié)果中國(guó)廣西人群存在miR181基因rs16927589多態(tài)性，有TT、TC和CC三種基因型，其頻率分別為73.6%、25.4%和10%，含T和C兩種等位基因，頻率分別為86.3%和13.7%，兩者男女組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與HapMapHCB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但與HapMapGIH、HapMapLWK、HapMapJPT及HapMapCEU比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。結(jié)論在中國(guó)廣西人群存在miR181基因rs16927589多態(tài)性，且在不同地域和種族人群間比較存在差異。不同種族和地區(qū)人群SNP差異可能是miR181基因相關(guān)疾病在臨床表現(xiàn)和發(fā)病率不同的重要因素之一。

【關(guān)鍵詞】miR181基因；單核苷酸多態(tài)性；種族

中圖分類(lèi)號(hào)：R394 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2018.02.001

Distribution character of SNP at rs16927589 locus of

miR181 gene in Guangxi population of China

WANG Chunfang，LEI Ming，PANG Xiaoxia，HUANG Huatuo，WANG Junli，WEI Guijiang，WEI Yesheng

（Department of Laboratory Medicine，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】ObjectiveTo analyze the distribution character of （single nucleotide polymorphism，SNP） at rs16927589 locus of miR181 gene in Guangxi population of China，and to compare the genotypes and allele frequencies of them with those of other races and regions.MethodsSNaPshot SNP and DNA sequencing were used to detect SNPs at rs16927589 loci in 299 Guangxi population of China.And statistical method was used to analyze differences of genotypes and allele frequencies between Guangxi population，HapMapHCB，HapMapJPT，HapMapLWK，HapMapGIH and HapMapCEU published by （Haplotype map，HapMap）.ResultsThere was rs16927589 polymorphism of miR181 gene in Guangxi population of China.There were three genotypes（TT，TC and CC），the frequencies of which were 73.6%， 25.4% and 1.0%，respectively，and there were two allels（T and C），the frequencies of which were 86.3% and 13.7%，respectively.Difference of genotypes and allele frequencies of rs16927589 polymorphism between men and women was statistically significant（P>0.05），difference between Guangxi population and HapMapHCB was not statistically significant（P>0.05），but that between Guangxi population，HapMapGIH，HapMapLWK，HapMapJPT and HapMapCEU was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.ConclusionRs16927589 polymorphism of miR181 gene exists in Guangxi population of China，and there are differences between varied regions and ethnic groups.The difference of SNP in varied ethnic groups and regions may be one of the important factors of different clinical manifestations and morbidity of miR181 gene related diseases.

【Key words】miR181 gene；SNP；race

microRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 nt的調(diào)控性小分子，作為非編碼家族的新成員之一，沒(méi)有開(kāi)放閱讀框架，但在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、代謝和應(yīng)激等過(guò)程中具有多種生物學(xué)行為[1]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)生存在遺傳易感性，并與其表達(dá)存在相關(guān)性[2～4]。病例研究發(fā)現(xiàn)，primiR34b/c rs4938723 SNP顯著增加了宮頸癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[4]。miR143/145啟動(dòng)子區(qū)rs4705342 SNP顯著降低了缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。miR181通過(guò)影響T細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)育等在SLE發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，如導(dǎo)致免疫復(fù)合物清除能力下降、細(xì)胞凋亡增加[5～7]。但至今miR181基因多態(tài)性與SLE的遺傳易感性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用SNaPshot SNP分型和DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)中國(guó)廣西地區(qū)299例健康人群rs16927589多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與HapMap公布的不同種族和地區(qū)人群的結(jié)果進(jìn)行比較，分析不同地域和種族人群間rs16927589多態(tài)性的分布差異情況，為后期miR181基因參與的相關(guān)疾病防治的研究及人類(lèi)群體遺傳學(xué)研究提供參考資料。

1對(duì)象與方法1.1對(duì)象篩選本地來(lái)我院體檢的無(wú)親緣關(guān)系的健康人群299例，女261例，男38例，年齡24～67歲，實(shí)驗(yàn)室檢查各項(xiàng)指標(biāo)及臨床體檢均無(wú)異常，排除患有感染、心腦血管及腫瘤等疾病。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取EDTAK2抗凝管采集體檢者靜脈血3 ml，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫徊捎萌祟?lèi)全血DNA提取試劑盒（深圳亞能）提取樣本DNA，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，根據(jù)NCBI中Genebank基因庫(kù)人miR181基因的全長(zhǎng)序列，選取包含rs16927589位點(diǎn)的適宜長(zhǎng)度DNA片段，用primer 30軟件設(shè)計(jì)引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs16927589上游引物序列為：5TAATTAGGGGCAAGGGGAGGAT3，下游引物序列為：5TATGTGGGGATATGTGGGCACT3，延伸引物為：5TTTTTTTTTTTTTTTTTTCAAAGTGAAATGTGATAAGAACTGTC3。

1.2.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序?qū)iR181基因rs16927589進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總體系為20 μL，其中含1x GCI buffer（Takara）2.0 μL，0.3 mmol/L dNTPs 20 μL，上、下游引物各1.0 μL， TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μL，用純水補(bǔ)至20 μL體系后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2 U外切酶I（EXO I，Epicentre公司）和5 U蝦堿酶（SAP，Promega公司提供）純化后，應(yīng)用SNaPshot Multiplex Kit （ABI 公司提供）進(jìn)行延伸反應(yīng)，最后經(jīng)1 U SAP酶純化延伸產(chǎn)物上樣ABI3130XL電泳儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co.，Ltd.，USA）分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 23.0軟件包分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因的頻率，用四格表χ2和行×列表χ2檢驗(yàn)計(jì)算比較各組間基因型及等位基因頻率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果2.1miR181基因rs16927589分型miR181基因rs16927589PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為167 bp，其分型結(jié)果顯示，rs16927589位點(diǎn)存在TT、TC和CC三種基因型，頻率分別為73.6%、25.4%和1.0%，等位基因T和C的頻率分別為86.3%和13.7%。DNA測(cè)序證實(shí)基因型結(jié)果一致。見(jiàn)圖1。

2.2廣西人群miR181基因rs16927589多態(tài)性在不同性別的比較經(jīng)χ2檢驗(yàn)，本研究納入人群miR181基因rs16927589基因型數(shù)據(jù)符合哈迪溫伯格平衡（HardyWeinberg equilibrium，HWE）定律（P=0200），說(shuō)明研究對(duì)象具有群體代表性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，rs16927589位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在廣西人群男女性別間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。見(jiàn)表1。

2.3廣西地區(qū)人群miR181基因rs16927589基因型和等位基因頻率與其他不同地域和種族人群的比較 廣西人群miR181基因rs16927589基因型及等位基因頻率與HapMapJPT、HapMapLWK、HapMapGIH及HapMapCEU人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01），但與HapMapHCB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。見(jiàn)表2和表3。注：①、②、③箭頭指向分別表示TT、TC、CC基因型

3討論miR181基因簇由miR181a、miR181b、miR181c和miR181d組成，前兩者分別位于1號(hào)和9號(hào)染色體上，后兩者則位于19號(hào)染色體上。人類(lèi)基因組單體型圖計(jì)劃研究發(fā)現(xiàn)，miR181基因存在多個(gè)功能性SNPs 位點(diǎn)，這些位點(diǎn)多態(tài)性改變可能會(huì)引起miR181編碼活性及miR181基因相關(guān)疾病遺傳易感性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致miR181相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。前期關(guān)于基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性研究主要集中在蛋白編碼基因上[8～10]，較少涉及非編碼基因。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明微小RNA基因多態(tài)性與疾病的發(fā)病相關(guān)[11～13]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3]，miR143/145基因rs4705342位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦卒中的遺傳易感性相關(guān)，TT和CT基因型可顯著降低缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（TC vsTT：adjusted OR=0.74，95% CI，0.57～0.97； CC vsTT：adjusted OR=0.53，95% CI，0.34～0.83）。目前關(guān)于miR181基因多態(tài)性與疾病的遺傳易感性研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道?；蚨鄳B(tài)性多因種族、環(huán)境、地理位置、飲食和生活習(xí)慣等不同呈現(xiàn)不同程度差異，而同一SNP位點(diǎn)在不同種族、地區(qū)人群間對(duì)疾病遺傳易感性的影響也表現(xiàn)出很大區(qū)別[14]。例如，Geng等[15]發(fā)現(xiàn)IL17A基因rs2275913多態(tài)性與冠心病的發(fā)病相關(guān)，然而墨西哥學(xué)者VargasAlarcon等[16]卻發(fā)現(xiàn)rs2275913多態(tài)性與冠心病的遺傳易感性無(wú)關(guān)。由此可見(jiàn)，不同種族和地區(qū)人群間正常人群基因多態(tài)性研究可為我們提供這些地區(qū)人群的遺傳背景資料，為其與相關(guān)疾病的遺傳多態(tài)性研究提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

本研究檢測(cè)了中國(guó)廣西地區(qū)正常人群miR181基因rs16927589 存在多態(tài)性的分布情況，結(jié)果顯示其有TT、TC和CC三種基因型，含T和C兩種等位基因，以TT基因型（73.6%）與等位基因T （86.3%）常見(jiàn)，兩者在性別間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明廣西人群rs16927589無(wú)性別間差異。而與HapMap公布的不同人群SNP比較分析發(fā)現(xiàn)，我國(guó)廣西健康人群miR181基因rs16927589基因型及等位基因頻率與HapMapJPT、HapMapLWK、HapMapGIH及HapMapCEU人群比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與HapMapHCB人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。廣西人群rs16927589 T和C等位基因頻率為86.3%和13.7%，與HapMapJPT（T，93.6%；C，10.4%）、HapMapLWK（T，95.6%；C，4.4%）、HapMapGIH（T，98.7%；C，13%）及HapMapCEU（T，100%）相差較大，與同是亞洲人的HapMapHCB（T，89.5%；C，10.5%）相差較小，結(jié)果吻合“親緣關(guān)系越近，基因型分布差異越小”的基因遺傳定律。結(jié)果也表明，基因多態(tài)性存在民族、種族和地域差異，同時(shí)與各地地理位置、環(huán)境、氣候、飲食和生活習(xí)慣相關(guān)。

綜上所述，中國(guó)廣西人群存在miR181基因rs16927589多態(tài)性，其基因型和等位基因頻率在不同種族和不同地區(qū)人群之間比較存在不同程度的差異。對(duì)中國(guó)廣西人群miR181基因rs16927589多態(tài)性研究，不僅有助于辨析miR181家族基因與其相關(guān)疾病的發(fā)生在不同種族、不同地域表現(xiàn)的差異，而且進(jìn)一步為相關(guān)疾病防治的研究及人類(lèi)群體遺傳學(xué)研究提供參考資料。參考文獻(xiàn)[1]Vidigal JA，Ventura A.The biological functions of miRNAs：lessons from in vivo studies[J].Trends Cell Biol，2015，25（3）：137147.

[2]Talaat RM，Alrefaey SA，Bassyouni IH，et al.Genetic polymorphisms of interleukin 6 and interleukin 10 in Egyptian patients with systemic lupus eythematosus[J].Lupus，2016，25（3）：255264.

[3]Wei YS，Xiang Y，Liao PH，et al.An rs4705342 T>C polymorphism in the promoter of miR143/145 is associated with a decreased risk of ischemic stroke[J].Sci Rep，2016，6：34620.

[4]Yuan F，Sun R，Chen P，et al.Combined analysis of primiR34b/c rs4938723 and TP53 Arg72Pro with cervical cancer risk[J].Tumour Biol，2016，37（5）：62676273.

[5]Neilson JR，Zheng GX，Burge CB，et al.Dynamic regulation of miRNA expression in ordered stages of cellular development[J].Genes Dev，2007，21（5）：578589.

[6]Shen N，Jiang L，Li Q，et al.The epigenetic effect of microRNA in BCRABL1positive microvesicles during the transformation of normal hematopoietic transplants[J].Oncol Rep，2017，38（5）；32783284.

[7]Carlsen AL，Schetter AJ，Nielsen CT，et al.Circulating microRNA expression profiles associated with systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum，2013，65（5）：13241334.

[8]Mohamed HT，ElHusseiny N，ElGhonaimy EA，et al.IL10 correlates with the expression of carboxypeptidase B2 and lymphovascular invasion in inflammatory breast cancer：The potential role of tumor infiltrated macrophages[J].Curr Probl Cancer，2018，pii：s01470272（17）3012030124.

[9]Shehjar F，Afroze D，Misgar RA，et al.Association of polymorphic variants of IL1beta and IL1RN genes in the development of Graves disease in Kashmiri population （North India）[J].Hum Immunol，2018，79（4）：228232.

[10]Mustafa S，F(xiàn)atima H，F(xiàn)atima S，et al.Association of single nucleotide polymorphism in CD28（C/TI3 + 17） and CD40 （C/T1） genes with the Graves disease[J].J Pak Med Assoc，2018，68（1）：39.

[11]Cai MY，Cheng J，Zhou MY，et al.The association between premiR27a rs895819 polymorphism and myocardial infarction risk in a Chinese Han population[J].Lipids Health Dis，2018，17（1）：7.

[12]Danesh H，Hashemi M，Bizhani F，et al.Association study of miR100，miR1241，miR2182，miR301b，miR605，and miR4293 polymorphisms and the risk of breast cancer in a sample of Iranian population[J].Gene，2018，647：7378.

[13]Wu F，Li M，You W，et al.A Genetic Variant in miR124 Decreased the Susceptibility to Esophageal Squamous Cell Carcinoma in a Chinese Kazakh Population[J].Genet Test Mol Biomarkers，2018，22（1）：2934.

[14]黃華佗，王榮，陸玉蘭，等.白細(xì)胞介素17A基因rs3748067位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在廣西人群中的分布特點(diǎn)[J].右江醫(yī)學(xué)，2017，45（4）：389393.

[15]Geng GY，Liu HL，Zhao YJ，et al.Correlation between polymorphisms in the IL17A and IL17F genes and development of coronary artery disease[J].Genet Mol Res，2015，14（3）：1148811494.

[16]VargasAlarcon G，AngelesMartinez J，VillarrealMolina T，et al.Interleukin17A gene haplotypes are associated with risk of premature coronary artery disease in Mexican patients from the Genetics of Atherosclerotic Disease （GEA） study[J].PLoS One，2015，10（1）：e0114943.

（收稿日期：2018-01-25修回日期：2018-0321）

（編輯：梁明佩）