孔繁菲，馬劍，叢蓉，楊慧，冷洪銳，馬曉欣

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110022）

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤［1］，多數(shù)發(fā)生于50歲以上婦女。全面徹底了解子宮內(nèi)膜癌流行病學(xué)、病理生理學(xué)和管理策略有助于婦產(chǎn)科醫(yī)生識別患病風(fēng)險增加的婦女，并有利于該病的早期診斷［2］。針對子宮內(nèi)膜癌有效的靶向治療是臨床醫(yī)生亟待思考的問題，其分子機(jī)制也成為近幾年的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜癌被認(rèn)為與“不和諧”激素產(chǎn)生有關(guān)，microRNA （miRNA） 是調(diào)節(jié)激素產(chǎn)生的主要因子之一［3］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p不僅在冠狀動脈疾?。?］和特發(fā)性肺纖維化［5］的發(fā)生過程中發(fā)揮作用，并在結(jié)直腸癌［6］、口咽鱗狀細(xì)胞癌［7］、血管肉瘤［8］和人乳頭瘤病毒 （human papillomavirus，HPV） 感染的宮頸癌［9］中差異表達(dá)。但有關(guān)miR-497-5p與子宮內(nèi)膜癌關(guān)系的研究目前尚未見報道，因此，本研究擬探討miR-497-5p的表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本：選取中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院2011年至2017年期間行子宮內(nèi)膜活檢診斷的子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜組織110例 （子宮內(nèi)膜癌組） ，患者年齡26～76歲，平均54.37歲；非典型增生子宮內(nèi)膜20例（非典型增生組） ，患者年齡30～60歲，平均50.85歲；因?qū)m頸病變行全子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織30例 （正常子宮內(nèi)膜組，其中包括增生期內(nèi)膜及分泌期內(nèi)膜組織） ，患者年齡34～67歲，平均46.4歲。上述患者在術(shù)前均未行放化療及激素治療。110例子宮內(nèi)膜癌中，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟 （FIGO 2009） 臨床分期及病理分級，Ⅰ期30例，Ⅱ期30例，Ⅲ期30例，Ⅳ期20例；根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分級，高分化子宮內(nèi)膜癌38例，中低分化子宮內(nèi)膜癌72例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性27例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性83例；浸潤子宮肌層＜1/2者61例，浸潤子宮肌層≥1/2者49例。標(biāo)本離體后，及時用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。所有切片均經(jīng)2名高級職稱病理醫(yī)師復(fù)閱診斷。本研究經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn) （編號：2017PS171K） 。

1.1.2 主要試劑：miR-497-5p原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，Mayer蘇木素染液購自北京索萊寶公司。

1.2 原位雜交檢測

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后，用3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，暴露mRNA核酸片段。用1%多聚甲醛室溫固定10 min，滴加預(yù)雜交液進(jìn)行恒溫41 ℃預(yù)雜交4 h，洗去多余液體。直接滴加雜交液 （miR-497-5p的專項探針序列為5’-ACAAACCACAGTGTGCTGCTG-3’） ，并用原位雜交專用蓋玻片蓋在切片上，恒溫41℃雜交過夜。次日，洗滌后滴加封閉液，再滴加生物素化鼠抗地高辛，37 ℃孵育60 min；之后依次滴加SABC和生物素化過氧化物酶；DAB顯色后蘇木素復(fù)染，充分水洗；乙醇脫水，二甲苯透明，封片；去除雜交液作為陰性對照。所有圖像 （×400） 均由正置顯微鏡獲取。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定

采用雙盲評分法判定原位雜交結(jié)果，miR-497-5p mRNA陽性反應(yīng)顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片隨機(jī)選取5個視野 （×400） ，按著色強(qiáng)度及陽性區(qū)域所占的百分比進(jìn)行結(jié)果判定。按著色強(qiáng)度評分：0分，無著色；1分，淺黃色；2分，黃色；3分，棕黃色以及棕褐色。按陽性區(qū)域所占百分比評分：陰性為0分，陽性區(qū)域所占百分比≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。取2項評分的乘積作為總分，≤2分為陰性 （-） ，3～4分為弱陽性 （+） ，5～8分為中度陽性 （++） ，9～12分為強(qiáng)陽性 （+++） 。-/+為低表達(dá)，++/+++為高表達(dá)。由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理切片觀察者分別閱片以控制誤差。

1.4 生物信息學(xué)分析

為了驗(yàn)證miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與生存時間的關(guān)系，本研究組從癌癥和腫瘤基因圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫獲取了miR-497-5p的mRNA的組織表達(dá)數(shù)據(jù) （其中子宮內(nèi)膜癌546例，對照組33例） 以及537例子宮內(nèi)膜癌患者的生存時間數(shù)據(jù)，并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2或Fisher確切概率檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中miR-497-5p的表達(dá)

原位雜交結(jié)果表明，miR-497-5p mRNA定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色、棕褐色均勻顆粒狀或片狀。子宮內(nèi)膜癌組、非典型增生組和正常子宮內(nèi)膜組miR-497-5p的陽性表達(dá)率分別為64.5%（71/110）、90% （18/20）、93.3% （28/30） ，子宮內(nèi)膜癌組織和非典型增生子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織 （圖1） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001，P= 0.004 4） （表1） 。此外，從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取546例子宮內(nèi)膜癌和33例正常子宮內(nèi)膜組織的miR-497-5p的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析顯示其在子宮內(nèi)膜癌組織明顯低于正常子宮內(nèi)膜組織 （圖2） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P= 0.003） 。

2.2 miR-497-5p的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系

高分化子宮內(nèi)膜癌組織中miR-497-5p的高表達(dá)率 （52.6%，20/38） 明顯高于中低分化子宮內(nèi)膜癌組織 （8.3%，6/72，P＜ 0.001） 。早期內(nèi)膜癌 （Ⅰ～Ⅱ期）中miR-497-5p的高表達(dá)率 （36.7%，22/60） 明顯高于晚期內(nèi)膜癌 （Ⅲ～Ⅳ期） （8.0%，4/50），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001） 。腫瘤浸潤深度＜1/2子宮內(nèi)膜癌組織中miR-497-5p的高表達(dá)率 （31.1%，19/61） 明顯高于浸潤深度≥1/2子宮內(nèi)膜癌組織 （14.3%，7/49），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.039） 。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織miR-497-5p的高表達(dá)率 （28.9%，24/83）明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （7.4%，2/27），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P= 0.022） 。miR-497-5p的表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡無明顯相關(guān)性 （P＞ 0.05） （表2） 。

圖1 miR-497-5p在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 原位雜交法 ×400Fig.1 Expression of miR-497-5p in endometrium tissue In situ hybridization ×400

圖2 對TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-497-5p在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)分析 （實(shí)時PCR）Fig.2 Real-time PCR analysis of miR-497-5p expression in endometrial tissues （data retrieved from the TCGA dataset）

表1 miR-497-5p在正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of miR-497-5p in normal endometrial tissue，atypical endometrial hyperplasia tissue，and endometrial carcinoma tissue

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中269例miR-497-5p低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者及268例miR-497-5p高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者的生存時間數(shù)據(jù)行進(jìn)生存分析，結(jié)果顯示，miR-497-5p高表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者較低表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者生存率高 （P＜ 0.05） （圖3） 。

3 討論

miRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，在不同的生物學(xué)過程和癌癥進(jìn)展中起重要作用［10］。miR-497是由人類染色體17p13.1上的MIR497HG（基因ID：100506755） 基因的第一內(nèi)含子編碼的高度保守的miRNA，屬于miR-15家族 （miR-15a，miR-15b，miR-16，miR-195，miR-424和miR-497） ，此家族共享相同的3’-UTR結(jié)合種子序列AGCAGCA［11］。miR-497已被報道為多種人類癌癥的腫瘤抑制劑。

研究［12］表明，miR-497-5p在骨肉瘤組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)，骨肉瘤細(xì)胞中miR-497-5p過表達(dá)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并在體外誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期停滯和凋亡。此外，miR-497在卵巢癌組織和SKOV3細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，SKOV3細(xì)胞中miR-497過表達(dá)可誘導(dǎo)PAX2蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［13］。在患HPV感染的中國維吾爾族女性宮頸癌中，miR-497-5p在癌組織中的的表達(dá)顯著低于正常組織［9］。但miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌中的臨床意義尚未見報道。

表2 miR-497-5p與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 Relationship between miR-497-5p and clinical pathological parameters of endometrial carcinoma

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中子宮內(nèi)膜癌組織中miR-497-5p高低表達(dá)與預(yù)后分析Fig.3 Kaplan-Meier survival curves for endometrial cancer cases with high and low miR-497-5p expression （data retrieved from the TCGA dataset）

本研究利用原位雜交方法檢測了子宮內(nèi)膜癌、非典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織中miR-497-5p的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織及非典型增生子宮內(nèi)膜組織中，miR-497-5p的表達(dá)水平均明顯低于正常內(nèi)膜組織，提示miR-497-5p可能參與子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生發(fā)展過程。本研究又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-497-5p的表達(dá)與臨床FIGO分期、分化級別、腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床分期越高，分化等級越低，腫瘤浸潤深度越深，miR-497-5p的表達(dá)越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-497-5p的表達(dá)較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低。但是miR-497-5p的表達(dá)與患者年齡之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)，可能與組織標(biāo)本的個體特異有關(guān)。本研究組推測miR-497-5p可能通過與靶基因結(jié)合而影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的大量隨訪信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-497-5p的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的生存時間相關(guān)。以上研究結(jié)果提示，miR-497-5p可能為子宮內(nèi)膜病變進(jìn)展過程中的重要作用因子之一，并可能成為一種子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。

然而，本研究仍然存在一定的局限性。關(guān)于miR-497-5p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中如何影響腫瘤的增殖、遷移、侵襲以及凋亡的機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-497-5p可以作為子宮內(nèi)膜癌臨床風(fēng)險預(yù)測的參考指標(biāo)，本研究結(jié)果為其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供新的理論支持。

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