曹路遙，周　巖*，魏琦超，陳燕繪，陳亞東，2，藺一帆，田瑞婷

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省華隆生物技術(shù)有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003)

光合作用是地球碳-氧平衡的重要媒介，是植物賴以生存的基礎(chǔ)，也是決定作物產(chǎn)量高低的重要因素之一。作物中 90%以上的干質(zhì)量來源于光合作用，但是農(nóng)作物的光能利用效率比較低，目前高產(chǎn)的稻麥類作物的光能利用率僅為 1%～1.5%[1]，因此，改善作物的光合性能從而提高作物的生物產(chǎn)量成為作物遺傳改良的研究重點。

有研究發(fā)現(xiàn)，在C3植物中導(dǎo)入C4光合途徑中的關(guān)鍵酶，有提高C3植物葉片光合效率的作用，進(jìn)而可以使產(chǎn)量增加[2-4]。C4光合途徑中有許多酶的參與，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是其中的一個關(guān)鍵酶，該酶不僅可以通過固定大氣中的CO2為植物光合作用提供碳源，還可以回補(bǔ)三羧酸循環(huán)的草酰乙酸和蘋果酸，促進(jìn)N素同化，協(xié)調(diào)細(xì)胞的代謝活動，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的離子平衡和pH值[5]。

目前，該基因不僅從不同C4植物中克隆出來，并且已經(jīng)利用重組DNA技術(shù)成功導(dǎo)入到水稻、油菜、小麥、馬鈴薯等C3植物中，取得了一定的研究進(jìn)展[6-10]。Ku等[11]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將玉米的pepc基因?qū)氲剿局腥ィ@得了轉(zhuǎn)pepc基因水稻，其光合生理性狀和種子的產(chǎn)量都得到提高。張艷等[12]將高粱C4型全長pepc基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)T0代植株和T1代植株的凈光合速率較對照相比分別提高了37.4%和20.7%，且凈光合速率增幅越大則單株產(chǎn)量增加也越多。馬宏敏[13]以轉(zhuǎn)甘蔗pepc基因的秈稻植株和非轉(zhuǎn)基因的植株為研究材料，發(fā)現(xiàn)在光合效率和產(chǎn)量相關(guān)性狀方面，轉(zhuǎn)甘蔗pepc基因植株都有較大提高，可以實現(xiàn)增產(chǎn)目的。張桂芳等[14]首次將含有稗草根型的pepc基因?qū)λ具M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻的PEPC活性最高,為對照的 5.85 倍，植株葉片的凈光合速率(Pn)較對照相比提高了20.00%。尹吳等[15]發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)玉米pepc基因的楊樹表現(xiàn)出較強(qiáng)的光利用能力，其羧化能力和酶活性與對照相比最高可分別增加62.3%和38.6%。吳瓊等[16]發(fā)現(xiàn)，與對照周麥19相比，轉(zhuǎn)玉米pepc基因的小麥在單穗質(zhì)量、千粒質(zhì)量、收獲指數(shù)等方面得到顯著提高。

表達(dá)載體構(gòu)建的方法有很多，例如傳統(tǒng)酶切連接法、一步克隆法等。傳統(tǒng)載體構(gòu)建的方法是利用多克隆位點，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶和連接酶構(gòu)建載體，中間需要一系列的酶切、連接、轉(zhuǎn)化、回收工作，此種方法雖然簡便，但是比較繁瑣，且費時費力，不適合構(gòu)建長片段、多片段拼接的復(fù)雜載體。另外，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因序列較長，即使克隆成功，也不容易連入表達(dá)載體[17]。Gateway克隆技術(shù)是Invitrogen公司開發(fā)的一套分子克隆新技術(shù)，主要通過運用BP和LR 2個重組反應(yīng)來構(gòu)建載體，首先需要把目的基因?qū)氲饺腴T載體(Entry Vector)上，然后就可以不用限制性內(nèi)切酶，單靠重組酶和載體上的特定重組位點就可以快速高效地將目的基因克隆到Gateway目標(biāo)載體(Destination Vector)上。由于Gateway克隆技術(shù)的適應(yīng)性、高效性和兼容性等特點，使得該技術(shù)成為最廣泛應(yīng)用和效率最高的重組克隆技術(shù)[18]。本研究利用同源克隆和RT-PCR技術(shù)從玉米自交系品種 ZD410 中成功克隆出C4途徑關(guān)鍵酶pepc基因的cDNA全長，并對其氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索分析，證實其屬于PEPC大家族；利用Gateway克隆技術(shù)成功構(gòu)建了含pepc目的基因的表達(dá)載體 pEXPR-PEPC；通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法對模式植物擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)PCR及RT-PCR檢測，初步證實獲得27株轉(zhuǎn)pepc基因陽性植株。并對pepc基因克隆和載體構(gòu)建中存在的問題進(jìn)行討論，以期為C4途徑關(guān)鍵酶pepc基因的高表達(dá)克隆載體的構(gòu)建及農(nóng)作物的高光效基因工程育種和抗逆性育種研究提供參考。

1　材料和方法

1.1　供試材料

1.1.1植物材料供試植物材料為玉米自交系品種 ZD410(河南科技學(xué)院生命科學(xué)院陳士林教授提供)、野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaL，河南科技學(xué)院作物基因組學(xué)與遺傳改良實驗室保存)，本研究試驗材料均種植于光照培養(yǎng)箱(16 h 12 000 lx 光照和 8 h 黑暗)。

1.1.2菌株及質(zhì)粒pEASY-Blunt Zero 克隆載體和 Trans1-T1 Phage Resistant Chemically 感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Gateway 入門載體 pENTR-VIR、表達(dá)載體pDEST-COT及農(nóng)桿菌菌株GV3101pMP90均由本中心實驗室保存。

1.1.3主要試劑植物總 RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及膠回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 購自 Kapa Biosystems 公司；Taq DNA Polymerase 購自天根生化科技(北京)有限公司；NotⅠ-HF、XmaⅠ、T4 DNA聚合酶均購自 NEB 公司；Gateway LR Clonase Ⅱ enzyme mix 購自 Invitrogen 公司；引物合成和測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)完成；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2　試驗方法

1.2.1玉米葉片總RNA的提取和cDNA的合成取0.1 g新鮮的幼嫩玉米葉片迅速置于液氮中研磨，按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit說明書提取玉米葉片總RNA；以總RNA為模板，按TaKaRa PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的全長克隆根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已發(fā)表的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA 全長序列(登錄號：AY103747)，運用軟件 Primer 5.0 設(shè)計 PEPC 全長特異性引物、β-actin內(nèi)參引物。

pepc:5-CGCTTCCGTGCTTAGCTTCCCG-3,

5-GAGAAGCCGCCTAGCCAGTGTT-3;

β-actin:5-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3,

5-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3。

以 cDNA 為模版進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)， 25 μL 反應(yīng)體系如下：PCR grade water 15.25 μL、5×KAPA HiFi Fidelity 5.00 μL、10 mmol/L dNTP Mix 0.75 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL、cDNA模板2.00 μL、KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase 0.50 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s；61 ℃復(fù)性15 s；72 ℃延伸3 min；總共32個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，目的條帶用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 切膠回收，連接 pEASY-Blunt Zero 克隆載體，轉(zhuǎn)化 Trans1-T1 Phage Resistant Chemically 感受態(tài)細(xì)胞，待抗性平板上長出菌落后挑單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒后進(jìn)行 PCR 檢測，陽性菌液送去測序。

1.2.3植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.2.3.1構(gòu)建含pepc目的基因的入門載體在全長pepc基因兩側(cè)分別引入NotⅠ和XmaⅠ酶切位點，重新構(gòu)建含NotⅠ和XmaⅠ酶切位點的目的基因質(zhì)粒(命名為pEASY-PEPC)，pEASY-PEPC和pENTR-VIR分別用NotⅠ和XmaⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收pEASY-PEPC的3 000 bp目的條帶和原入門載體pENTR-VIR4 000 bp條帶，用T4 DNA聚合酶連接即成為新的入門載體，重新命名為pENTR-PEPC(圖1)。

圖1　玉米pepc基因入門載體構(gòu)建示意

1.2.3.2利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建含目的基因的表達(dá)載體將測序正確的重組質(zhì)粒pENTR-pepc和保存菌種pDEST-cot進(jìn)行LR反應(yīng)，得到表達(dá)載體pEXPR-pepc。5 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 1.30 μL、pENTR-pepc質(zhì)粒DNA 1.25 μL、pDEST-cot質(zhì)粒DNA 0.45 μL、TE buffer(pH值8.0)1.00 μL、Gateway LR Clonase Ⅱ enzyme mix 1.00 μL。在微型離心管中加入上述液體，輕微混合后，置于恒溫金屬浴上25 ℃反應(yīng)1 h，然后向混合液中加入1 μL Proteinase K solution，置于恒溫金屬浴上37 ℃反應(yīng)10 min，得到重組表達(dá)載體pEXPR-pepc(圖2)。

圖2　pepc全長基因表達(dá)載體構(gòu)建示意

1.2.3.3重組表達(dá)載體pEXPR-pepc的分子生物學(xué)檢測以重組質(zhì)粒pEXPR-pepc為模板，用含酶切位點的pepc全長目的基因檢測引物鑒定重組子，陽性重組子送去測序。

1.2.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞及鑒定取1 μL測序鑒定正確的pEXPR-pepc重組質(zhì)粒加入100 μL GV3101pMP90感受態(tài)，冰浴30 min；然后置于-70 ℃冰箱冷凍10 min；42 ℃水浴熱激90 s；冰浴2 min；在超凈工作臺中加500 μL不添加任何抗生素的YEB 液體培養(yǎng)基，180 r/min 28 ℃復(fù)蘇3 h；將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含有 Kan、Rif和Gent(終質(zhì)量濃度都為50 mg/L)的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)；菌落出現(xiàn)后，挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行 PCR 檢測。

1.2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化

1.2.5.1農(nóng)桿菌浸染液的制備挑取單菌落接種于10 mL含相應(yīng)抗生素的YEB 培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再次加入100 mL YEB，在相同條件下培養(yǎng)到OD600值大于或等于1；將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4 000 r/min離心15 min，沉淀用制備好的懸浮液懸浮，調(diào)整OD600到0.8～1.0。懸浮液配方如下(500 mL)：MSB5 1.1 g、蔗糖25 g、6-BA 2.5 μL(2 mg/mL)、Silwet L-77 100 μL，調(diào)整pH值到5.7。

1.2.5.2花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥在進(jìn)行轉(zhuǎn)化的前一天將擬南芥用營養(yǎng)液澆透，選取同一時期花蕾較多的擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時將野生型擬南芥的所有花序放入制備好的農(nóng)桿菌浸染液中浸泡30 s；然后將花盆側(cè)放到鋪有濕潤報紙的塑料托盤上；用黑色塑料袋對其進(jìn)行遮光保濕16 h；后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)至正常培養(yǎng)；1周后觀察植株長勢，可對生長強(qiáng)壯的植株重復(fù)進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，以提高轉(zhuǎn)化率；轉(zhuǎn)化5～6周后，為了加速擬南芥種子的成熟可適量少澆營養(yǎng)液，待植株枯黃以后，即可收取種子。

1.2.5.3轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的篩選將收獲的T1代擬南芥種子放入50 mL離心管中，加入適量滅菌的0.1%的瓊脂糖，均勻混合后放入4 ℃冰箱春化 2～3 d；將春化后的種子混合液用移液槍吸取，均勻滴至營養(yǎng)基質(zhì)上(丹麥營養(yǎng)土、蛭石1∶)，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行正常培養(yǎng)；對長出4片真葉的幼苗先用10 000倍Basta溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)均勻噴灑植株葉片，間隔1周左右再用5 000倍Basta溶液噴灑2遍；待擬南芥植株抽薹以后，對具有Basta抗性的植株葉片進(jìn)行PCR檢測。

1.2.5.4轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的PCR檢測跨啟動子和目的基因序列設(shè)計檢測引物，對經(jīng)過 3 遍Basta溶液篩選后仍能正常生長的擬南芥植株葉片組織直接進(jìn)行PCR鑒定。詳細(xì)引物信息及擴(kuò)增體系如下：

NJS：5-CCTACACGCTGAAGCGGATAAGG-3,

NJA：5-TTATTAGTTCGCCGCTCGGTGTGTCG-3。

20 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 7.60 μL、2×Phire Plant PCR Buffer 10.00 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL、Phire Hot Start Ⅱ DNA Polymerase 0.40 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性5 s；58 ℃復(fù)性10 s；72 ℃延伸25 s；總共40個循環(huán)；72 ℃再延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5.5轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的RT-PCR檢測根據(jù)全長基因序列設(shè)計檢測引物，對PCR檢測的擬南芥陽性植株提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR鑒定。詳細(xì)引物信息及擴(kuò)增體系如下：

NJS1：5-TCGTCTTCACCGCGCATCCCAC-3,

NJA1：5-CACGCCCTTCCATACAGTCTCA-3。

25 μL反應(yīng)體系如下：滅菌ddH2O 19.50 μL、10×TaqBuffer 2.50 μL、dNTP Mixture 0.50 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.50 μL、DNA Polymerase 0.50 μL、樣品 1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s,55 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,總共32個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1　葉片總RNA及目的基因RT-PCR產(chǎn)物檢測

玉米葉片總RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果表明(圖3),提取的葉片總RNA明顯可見28S和18S 2條帶，帶型清晰，完整性良好，紫外分光光度計檢測OD260/280在1.8～2.1。以 cDNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,在3 kb左右處有1條亮帶，與預(yù)期片段長度一致(圖4)。

圖3　玉米葉片總RNA的凝膠電泳結(jié)果

M：Marker DL5000(下同)； 1：β-actin 750 bp； 2：PCR products圖4　玉米pepc cDNA的PCR產(chǎn)物電泳分析

2.2　回收全長目的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞及陽性菌落的PCR檢測

切膠回收全長目的基因RT-PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant Chemically感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布在含有Amp的平板上，37 ℃過夜倒置培養(yǎng)，有白色菌落出現(xiàn)(圖5)。從LB平板上挑取白色單菌落轉(zhuǎn)移到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃過夜擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒后(圖6)，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定。如圖7所示質(zhì)粒PCR產(chǎn)物大小與目的片段大小一致，初步斷定為目的基因重組子，將重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果正確的菌液送去測序，以確定全長目的基因序列。

圖5　LB固體培養(yǎng)基上的玉米pepc重組子

圖6　重組質(zhì)粒的電泳分析

圖7　重組質(zhì)粒的PCR電泳

2.3　玉米pepc全長基因克隆序列分析

測序結(jié)果顯示，玉米pepc基因全長cDNA序列為2 952 bp，包括完整的開放閱讀框2 913 bp，共編碼970個氨基酸，此外還包括5′非編碼區(qū)序列 29 bp和3′非編碼區(qū)序列13 bp；用 ProtParam(physico-chemical parameters of a protein sequences，http://web.expasy.org/protparam/)在線程序?qū)υ撔蛄羞M(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因分子質(zhì)量約為 108.179 ku，分子式為 C4675H7304N1344O1547S34，PI為5.73，不穩(wěn)定系數(shù)為37.19，脂肪系數(shù)為46.66；其含量較高的氨基酸有Thr(15.9%)、Glu(8.2%)、Ala(7.3%)、Arg(6.9%)、Gly(6.8%)；對該蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析，顯示出該PEPC蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示該蛋白質(zhì)不存在跨膜區(qū)。

運用 NCBI 上的 BLast軟件對其氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索分析，在多個數(shù)據(jù)庫中顯示檢索的序列大多為pepc基因，且具有極高的同源性。篩選出幾種典型C4植物的pepc基因氨基酸序列，用DNAMan軟件對其進(jìn)行多序列比對分析。其中氨基酸序列同源性由高到低依次是甘蔗(Saccharumofficinarum)、高粱(Sorghumvalgare)、谷子(Setariaitalica)、稗草(Echinochloacrugalli)，其對應(yīng)同源率分別達(dá)到達(dá)到 79.71 %、79.09 %、73.71 %、71.09 %。

2.4　玉米pepc全長基因表達(dá)載體的構(gòu)建

首先在全長目的基因兩端分別引入NotI和XmaI酶切位點，通過NotI和XmaI雙酶切、連接改造原有入門載體(圖8、圖9)，構(gòu)建含pepc基因全長的入門載體，命名為 pENTR-pepc(圖10)；菌液PCR及測序鑒定結(jié)果正確。入門載體pENTR-pepc和原有目的載體pDEST-cot進(jìn)行LR反應(yīng)，得到新的含pepc基因全長的表達(dá)載體pEXPR-pepc，菌液PCR及測序鑒定結(jié)果正確(圖11)。

1：pEASY-pepc質(zhì)粒DNA； 2：pEASY-pepc雙酶切產(chǎn)物；3：pENTR-vir質(zhì)粒DNA； 4：pENTR-vir雙酶切產(chǎn)物圖8　NotⅠ和XmaⅠ雙酶切

5：pENTR-vir雙酶切膠回收產(chǎn)物； 6—7：pEASY-pepc雙酶切膠回收產(chǎn)物圖9　雙酶切膠回收電泳結(jié)果

8—9：入門載體PCR圖10　入門載體PCR檢測結(jié)果

10—11：表達(dá)載體PCR圖11　表達(dá)載體PCR檢測結(jié)果

2.5　農(nóng)桿菌GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及鑒定

pEXPR-pepc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101pMP90感受態(tài)細(xì)胞(圖12)，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落接種于含有Kan、Rif和Gent的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩下過夜培養(yǎng)，pepc全長基因引物對菌液進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，能擴(kuò)增出來3 000 bp左右目的基因條帶(圖13)，說明重組質(zhì)粒pEXPR-pepc已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101pMP90。

圖12　農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

1—2：根癌農(nóng)桿菌PCR圖13　重組質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌的PCR撿測

2.6　轉(zhuǎn)pepc基因的擬南芥陽性植株的篩選與鑒定

對經(jīng)過3遍Basta溶液篩選后仍能正常生長的擬南芥植株葉片組織直接進(jìn)行PCR鑒定，如圖14所示，轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥陽性植株和pepc大腸桿菌質(zhì)粒DNA同樣都能擴(kuò)增出1 000 bp左右片段；對經(jīng)過PCR鑒定的陽性植株提RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，如圖15所示，轉(zhuǎn)基因植株和質(zhì)粒DNA同樣都能擴(kuò)增出200 bp左右目的條帶；初步證明玉米pepc基因經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸染法已成功轉(zhuǎn)入擬南芥。

M1：Marker DL 5000； 1、2：轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR結(jié)果； 3：質(zhì)粒 DNAPCR結(jié)果； 4：非轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR結(jié)果圖14　轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥的PCR檢測

M2：Marker DL 500； 5.質(zhì)粒DNA PCR結(jié)果； 6：非轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR結(jié)果； 7—9.轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR結(jié)果圖15　轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥的RT-PCR檢測

3　結(jié)論與討論

植物表達(dá)載體的構(gòu)建在植物基因工程中占據(jù)重要地位，而選擇合適的表達(dá)載體對外源基因的轉(zhuǎn)化和表達(dá)非常重要，本研究采用Gateway入門載體載體pENTR-vir、pDEST-cot成功構(gòu)建了含有C4植物pepc基因表達(dá)載體pENTR-pepc，使用草銨膦作篩選標(biāo)記，在T35S啟動子下表達(dá)pepc基因，為pepc基因表達(dá)提供了一個高效的載體，回避了在傳統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建中酶切位點選擇的局限性。同時由于具有致死基因ccdB，使未成功重組載體的大腸桿菌無法生長，有效減少了假陽性菌株，為后期篩選工作節(jié)省了時間。表達(dá)載體中有抗草銨膦篩選基因(PPT)，在對轉(zhuǎn)pepc基因擬南芥陽性植株篩選時，對長出4片真葉的幼苗間隔1周左右用適當(dāng)草銨膦溶液噴灑，未成功轉(zhuǎn)基因的擬南芥黃化死亡，轉(zhuǎn)基因擬南芥則不受影響，從而很大程度地減少了工作量[19]。

擬南芥是典型的模式植物，因此,玉米C4型pepc基因在擬南芥基因組中的表達(dá)與光合效應(yīng)分析更具有代表性。目前，對擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化最普遍的是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法，而侵染過程的很多方面直接影響著轉(zhuǎn)化的成功率。首先是轉(zhuǎn)化緩沖液的成分。在轉(zhuǎn)化緩沖液中，添加蔗糖不僅可以為農(nóng)桿菌提供轉(zhuǎn)化能量，而且可以使花粉內(nèi)外壓強(qiáng)保持一致。陳軍等[20]在油菜花藥的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度高低對花粉小孢子活力也有很大的影響。另外蔗糖還能在一定程度上誘導(dǎo)vir基因的表達(dá)，這將可以提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率[21]。為了使農(nóng)桿菌可以更好地吸附在植物表面，并且可以順利進(jìn)入植物組織細(xì)胞中去，一般還應(yīng)在轉(zhuǎn)化緩沖液中添加一定濃度的表面活性劑如Silwet L-77[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化擬南芥時添加Silwet L-77 的適宜濃度為0.05%[23]，濃度過高對結(jié)實率有顯著的抑制作用，且轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定。其次是農(nóng)桿菌的侵染濃度。Clough等[24]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)農(nóng)桿菌侵染液的OD600為0.8時轉(zhuǎn)化效果最好，濃度過高會影響擬南芥花絮的生長，過低則會降低轉(zhuǎn)化效率。但有些研究者發(fā)現(xiàn)，侵染液濃度OD600在0.15～1.74時對轉(zhuǎn)化效率影響不大[25]。最后是侵染的時間和次數(shù)。一般來說侵染時間過長可能會降低花絮的成活率，從而使結(jié)籽率相應(yīng)降低，影響后續(xù)試驗；侵染時間過短則會降低轉(zhuǎn)化的成功率。還有研究發(fā)現(xiàn)，間隔一段時間對擬南芥進(jìn)行重復(fù)侵染可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率[25]。本次試驗過程中，采用的浸染緩沖液配方為2.2 g/L MSB5、50 g/L蔗糖、0.044 μmol/L 6-BA和 200 μL/L silwetL-77，pH 值為 5.7，OD600為1.0左右，選取生長健壯，且同一時期花蕾較多的擬南芥進(jìn)行第一次轉(zhuǎn)化，1周后觀察植株長勢，對生長強(qiáng)壯的植株重復(fù)進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，該方法不僅轉(zhuǎn)化率比較高，而且轉(zhuǎn)化效果最好。本研究為進(jìn)一步分析玉米C4型pepc基因在C3植物中的表達(dá)分析奠定了研究基礎(chǔ)。