李小杰，李成軍，胡亞靜，李淑君，邱　睿，白靜科，陳玉國

(河南省農業(yè)科學院 煙草研究所 煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南 許昌 461000)

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的危害世界煙草生產的重要根莖部細菌性病害，在我國長江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，造成了巨大損失[1-2]。同時由于氣候等方面的原因，該病害已向北擴展蔓延。截至目前，在河南、安徽、山東、陜西等地已有煙草青枯病的發(fā)生并造成不同程度的損失[3-6]。

在生產上防治煙草青枯病主要依賴化學農藥，且到目前為止尚無有效的化學藥劑可防治青枯病。另外，大量使用化學農藥不僅污染環(huán)境，而且破壞生態(tài)[7-8]。隨著煙草及其制品逐漸向綠色安全化方向發(fā)展，生物防治成為煙草病害防治研究的熱點，尤其是全國煙草綠色防控重大專項的啟動實施，為煙草病害的防治提供了新思路和新方法，為煙區(qū)農產品質量和生態(tài)環(huán)境安全提供了有力保障。

用于植物病害生物防治的因子有很多，總體來說主要包括拮抗微生物、抗生素和植物誘導因子等，其中拮抗微生物的種類主要有細菌、真菌、放線菌和病毒等。關于生防細菌的篩選，大多數是從土壤或健康植物根際土壤中分離，這些土壤微生物的拮抗效果常受到外界環(huán)境的影響而穩(wěn)定性較差[9]。目前利用內生細菌防治煙草青枯病受到國內外專家的廣泛關注，并有很多相關文獻報道[10-12]，這些研究結果表明，大部分的內生細菌不僅可以抑制病原菌生長，同時還具有促生作用等[13-14]，且拮抗效果穩(wěn)定，具有很好的開發(fā)應用前景。但這些生防菌大多還處于試驗階段，實現(xiàn)商品化應用的很少。因此，在不同生態(tài)環(huán)境及不同植物中挖掘和發(fā)現(xiàn)新的有益內生細菌是很有必要的。豫南煙區(qū)是河南省煙草青枯病的發(fā)生區(qū)，為了得到對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果且穩(wěn)定的內生細菌菌株，本研究對豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的內生細菌進行了大量分離篩選和鑒定，并對其拮抗效果進行了初步分析，為河南煙區(qū)煙草青枯病的生物防治提供理論依據。

1　材料和方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試煙草品種豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87，培育至5～6片真葉備用。

1.1.2供試菌株煙草青枯病菌菌株TXLLJ14-3由煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室分離純化，用30%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.1.3供試培養(yǎng)基拮抗細菌的分離、培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，煙草青枯病菌的培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基。

1.1.4供試試劑拮抗細菌總DNA提取、16S rDNA片段擴增所用試劑均購自天根生化科技有限公司。

1.2　試驗方法

1.2.1內生細菌的分離與純化分別取健康煙草的根、莖0.1 g進行表面消毒，然后用無菌水漂洗1次，再用有效氯為1%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，立即轉入無菌水中漂洗4次。將消毒好的根或莖放入滅菌的研缽中進行研磨，研磨液離心后取上清用無菌水進行不同梯度的稀釋。取稀釋后的液體0.1 mL 涂布于LB培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)特征明顯不同的單菌落，于LB平板進行劃線純化，將純化好的菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2拮抗細菌的篩選將NA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右，按2%的比例加入過夜培養(yǎng)的煙草青枯病菌菌株TXLLJ14-3(濃度為1×1010cfu/mL)，搖勻后倒平板，用無菌牙簽在每個平板上均勻點接5個左右的參試內生菌株，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察并測定抑菌圈直徑。選取抑菌圈明顯或對病原菌生長影響較大的菌株保存?zhèn)溆?。復篩方法同初篩，再次篩選抑菌圈大且效果穩(wěn)定的菌株。

1.2.3拮抗細菌的16S rDNA 鑒定用細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株的基因組DNA，并以細菌16S rRNA基因的通用引物[4](F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)對菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應體系(25 μL)為：Taq酶0.3 μL，10×Buffer(Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 17.2 μL。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠對PCR 擴增產物進行電泳檢測，測序后將結果在NCBI上進行Blast比對，并選擇同源性較高的序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4不同方式處理的拮抗菌Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制作用測定將拮抗菌Rsa3在LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h后，分別配制成拮抗菌LB發(fā)酵液(OD600=1.0)、拮抗菌無菌水懸液(OD600=1.0)、無菌發(fā)酵液(0.22 μm濾膜過濾)，同時采用梯度稀釋法，分別制備10-1、10-2、10-3、10-4稀釋發(fā)酵液，用移液器吸取2 μL點接于含2%煙草青枯病菌的NA培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察并測定抑菌圈直徑。

1.2.5盆栽接種試驗將煙苗移栽于盛有無菌土的花盆中，5～7 d后每株澆10 mL拮抗菌發(fā)酵液100倍液(1×109cfu/mL)，24 h后接種煙草青枯病菌，采用傷根灌根法，每株灌菌懸液(3×108cfu/mL)10 mL，設置3個重復，每個重復接種10株煙苗，3 d后再澆施1次拮抗菌發(fā)酵液，用量及濃度與第1次相同，以清水為空白對照。接種后觀察煙株的發(fā)病情況，其分級標準參照全國煙草行業(yè)煙草病害調查分級標準YC/T 39—1996進行。病情指數和防治效果按煙草病害藥效試驗方法YC/T 40—1996計算。

青枯菌在煙苗組織內的含菌量測定：于接種后15 d取樣，取樣部位為煙株莖基部。每0.1 g樣本加入1 mL無菌水進行充分研磨，按10倍梯度稀釋，分別取不同稀釋液0.1 mL涂布于TTC培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h后進行平板菌落計數，然后換算成每克鮮質量青枯菌數。公式如下：

青枯菌活菌數(cfu/g)=

1.2.6拮抗細菌發(fā)酵液促進煙苗根系生長的測定將中煙100的種子用拮抗菌發(fā)酵液(濃度為3×108cfu/mL)進行浸種處理，然后置于MS培養(yǎng)基上，于(25±2)℃、光照12 h/d、光強3 000 lx條件下培養(yǎng)。待種子萌發(fā)后，用相同濃度的拮抗菌發(fā)酵液再噴霧1次，以清水作對照，每個處理3個重復。取生長20 d的幼苗，用直尺測量其根系長度。

1.3　數據分析

使用分析軟件DPS 7.05進行差異顯著性檢驗，采用Duncan’s新復極差法進行多重比較。

2　結果與分析

2.1　煙草青枯病菌拮抗內生細菌的分離和篩選

采用平板梯度稀釋法共分離出208株內生細菌菌株，經過初篩和復篩，共得到9株對煙草青枯病菌具有拮抗效果的細菌菌株，其編號分別為Rsa3、Rsa14、Rsa22、Rsa30、Rsa31、Rsa39、Rsa118、Rsa164、Rsa167，其中菌株Rsa3、Rsa22、Rsa30、Rsa39的拮抗效果較好(圖1)，尤其以Rsa3的抑菌效果最好，抑菌圈半徑達到7 mm，且在轉移5～6代后，其抑菌能力無明顯變化。

2.2　拮抗菌的16S rRNA 基因序列分析

將拮抗菌的16S rRNA基因序列在GenBank數據庫中進行比對分析，然后通過MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，篩選出的9株拮抗菌可歸為3個不同的屬。菌株Rsa3、Rsa22、Rsa30、Rsa31、Rsa39、Rsa164、Rsa167的16S rRNA基因序列與假單胞菌屬(Pseudomonas)同源相似度都在98%以上，其中拮抗效果最強的內生細菌菌株Rsa3與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)屬于同一進化分支(圖2)；菌株Rsa14的16S rRNA 基因序列與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)同源相似度為99%；菌株Rsa118的16S rRNA 基因序列與節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)同源相似度為93%。

圖1　煙草青枯病菌拮抗內生細菌的平板篩選結果

2.3　不同方式處理的拮抗菌Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病菌的拮抗效果

不同方式處理的Rsa3拮抗菌發(fā)酵液對煙草青枯病菌的平板抑制效果不同，其中拮抗菌LB發(fā)酵液和拮抗菌無菌水懸液對煙草青枯病菌具有較強的抑制作用，而無菌發(fā)酵液對煙草青枯病菌幾乎沒有抑制效果(圖3A)。當拮抗菌LB發(fā)酵液稀釋1 000倍時，拮抗效果幾乎沒有變化，稀釋到10-5時對煙草青枯病菌仍具有抑制效果(圖3B)。由此可以說明，拮抗菌Rsa3對煙草青枯病菌具有較好的抑制效果，且其抑制作用主要在于菌體本身，而非其代謝產物。

2.4　拮抗菌Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病的防治效果

選取對煙草青枯病菌拮抗作用最強的菌株Rsa3進行盆栽接種試驗，從結果可以看出，接種后10 d，澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株未見發(fā)病癥狀。接種后15 d，澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株明顯比對照煙株發(fā)病輕(圖4A)，拮抗菌Rsa3對青枯病的平均防治效果達79.17%(表1)。

圖2　拮抗內生細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

A：不同方式處理的Rsa3發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制效果(1.拮抗菌Rsa3 LB發(fā)酵液；2.拮抗菌Rsa3 無菌水懸液；3.無菌發(fā)酵液)；B：不同濃度的拮抗菌Rsa3 LB發(fā)酵液對煙草青枯病菌的抑制效果

A：接種后15 d不同處理的煙株發(fā)病情況；B：接種后15 d不同處理的煙株體內菌量統(tǒng)計分析

處理接種后10 d發(fā)病率/%病情指數防治效果/%接種后15 d發(fā)病率/%病情指數防治效果/%Rsa30B0B100.0012.50B11.11B79.17CK80.00A26.67A-80.00A53.34A-

注：同列不同大寫字母表示差異達1%顯著水平。

接種后15 d煙株體內的菌量分析結果表明，澆施拮抗菌發(fā)酵液處理的煙株體內青枯病菌含量明顯比對照煙株體內的青枯病菌含量低，且兩者之間具有極顯著差異(圖4B)。由此說明，拮抗菌Rsa3對煙草青枯病有較好的室內防治效果，具有潛在的應用價值。

2.5　拮抗菌Rsa3發(fā)酵液對煙苗根系的促生長效果

從圖5可以看出，煙草種子經Rsa3發(fā)酵液處理后20 d，煙苗根系平均長度為6.0 cm，明顯比對照(平均根長為2.3 cm)長。結果初步表明，拮抗菌Rsa3具有促進煙苗根系生長的能力。

圖5　拮抗菌Rsa3對煙苗根系的平板促生效果

3　結論與討論

本研究從豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的根莖中分離煙草青枯病菌的拮抗內生細菌，利用平板共培養(yǎng)法篩選出9株對煙草青枯病菌具有較好拮抗效果的細菌菌株，其中菌株Rsa3對煙草青枯病菌的抑菌效果最好，抑菌圈半徑達7 mm，且拮抗效果穩(wěn)定。通過分子生物學手段，將拮抗菌Rsa3鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。該菌對煙草青枯病菌有明顯的拮抗作用，且這種拮抗作用主要在于菌體本身，而非其代謝產物。拮抗菌Rsa3對煙草青枯病具有較好的防治作用，在溫室盆栽試驗中防病效果達到79.17%，具有較大的應用價值。

生物防治已成為現(xiàn)代農業(yè)生產中防治有害生物的一項重要措施，目前青枯病的生物防治措施主要包括利用無致病力菌株和拮抗微生物等，其中利用拮抗菌對青枯病進行防治的研究很多，尤其是內生拮抗細菌[13,15-17]。但由于拮抗菌的生長容易受環(huán)境和寄主植物的影響，因此分離適合當地植物病害防治的拮抗菌是必要和有益的。本研究從豫南煙區(qū)煙草栽培品種中煙100和云煙87的根莖中分離篩選到9株對煙草青枯病菌具有拮抗效果的細菌菌株，為豫南煙區(qū)煙草青枯病的生物防治奠定了有力基礎。

目前研究報道，分離到的植物內生細菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)及短小桿菌屬(Curtobacterium)等，其中以芽孢桿菌屬內生細菌對植物病害防治的報道較多[18-21]。本研究分離篩選到9株煙草青枯病的拮抗內生細菌菌株，其中有7株為假單胞菌屬，1株為節(jié)桿菌屬，還有1株為芽孢桿菌屬，這與前人的報道[18-21]一致，同時也初步說明防治豫南煙區(qū)煙草青枯病的拮抗內生細菌的優(yōu)勢種群為假單胞菌屬。本研究中屬于熒光假單胞菌的細菌菌株Rsa3對煙草青枯病菌的抑菌效果最好，且拮抗效果穩(wěn)定，同時對煙草青枯病具有較好的室內防治效果，可作為煙草青枯病生防菌的候選資源。

有研究表明，假單胞菌的作用機制之一是通過可泌出胞外的細菌素、抗生素等次生代謝產物實現(xiàn)[22]，其中假單胞菌中的著名抑菌活性物質申嗪霉素在國內已實現(xiàn)商品化[23-24]。但在本研究中，熒光假單胞菌Rsa3對煙草青枯病菌的拮抗作用主要在于菌體本身，而非其代謝產物，分析原因可能是不同地域、不同寄主植物中分離到的細菌菌株不同，其抑菌機制也就不同。

拮抗菌的防病和促生作用大都是相輔相成的，充分開發(fā)和利用自然界中的拮抗菌，可有效保護和促進植物生長。本研究篩選獲得的拮抗細菌菌株Rsa3對煙草青枯病具有較好的抑菌和防病作用，同時對煙苗的根系有明顯的促生長效果，具有較高的開發(fā)利用價值。