莊昆海 李海文 劉 洪 潘靜琳 劉鳳斌

慢性萎縮性胃炎 （chronic atrophic gastritis,CAG）伴有中、重度腸上皮化生和（或）異型增生與胃癌的發(fā)生有密切關系，CAG伴有腸上皮化生及異型增生是胃癌前病變，在胃黏膜癌前疾病中占有重要地位[1]。

長期慢性炎癥刺激可影響正常細胞的代謝和增殖，從而導致胃黏膜炎癥、異型增生和癌變過程。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是腫瘤細胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應、致癌作用以及抗放射的關鍵分子，也是趨化因子產(chǎn)生的核心轉錄因子[2-3]。NF-κB是多條信號通路的樞紐分子，調(diào)控一系列細胞因子的表達，炎性細胞因子又可進一步誘導NF-κB持續(xù)性活化。TNF-α是重要的炎性因子，TNF-α慢性刺激可促進腫瘤細胞的生長及轉移。TNF-α活化NF-κB，促進細胞增殖，由炎癥向癌癥轉化。p50為NF-κB1，以p65/p50的二聚體形式存在，可促使NF-κB入核，激活基因轉錄，從而導致炎癥反應的發(fā)生。

CAG屬于癌前疾病，研究炎癥通路中的關鍵因子在萎縮性胃炎癌變過程中的作用，有利于更好地明確CAG發(fā)展和轉歸的機理，為臨床用藥和治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、動物

選用70～80 d SPF級SD雄性大鼠94只，體重在170～200 g，由廣東省動物實驗中心提供（動物許可證號：SCXK[粵]2013-0002）。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，在室溫（22±2）℃，濕度55%±5%的環(huán)境中飼養(yǎng)，保持晝夜節(jié)律各12 h，自由飲食和喝水。

二、實驗藥物

1.胃萎清顆粒劑

藥物由北芪、白術、半枝蓮、莪術、五指毛桃、枳殼等組成。由廣東省一方制藥有限公司提供，并進行質量控制（批號：J1603001），提供質量合格證明。

2.葉酸片

由江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司提供（批準文號：國藥準字 H32023288，產(chǎn)品批號：1507026），規(guī)格為5 mg×100片/瓶。

3.N-甲基-N′-硝基-N′-亞硝基胍（MNNG）

由日本東京株氏會社提供，MNNG飲用液濃度為180μg/mL，裝入500 mL的避光飲水瓶中自由飲用，每2天更換一次。

三、動物分組及造模給藥

本研究購入94只70～80 d SPF級SD健康雄性大鼠，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組和CAG模型組。其中空白對照組14只，CAG模型組80只?？瞻讓φ战M給予正常飲食、自由飲水，直至整個實驗結束。CAG模型組則予濃度為180μg/mL的MNNG飲用液自由飲用，并在此基礎上采用經(jīng)典的饑飽失常法復制脾虛證（即喂食1 d，而后禁食1 d，如此循環(huán)），連續(xù)造模直至第14周，隨機抽取模型組中的兩只CAG大鼠，進行胃黏膜病理組織學檢查，結果顯示兩只大鼠胃黏膜病理組織學為胃黏膜固有腺體萎縮伴腸上皮化生為造模成功。

確定造模成功后開始給藥，將CAG模型組隨機分為5組：模型組，胃萎清高劑量組，胃萎清中劑量組，胃萎清低劑量組及葉酸組。其中模型組14只，胃萎清高、中、低劑量組及葉酸組均分別為16只，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水。胃萎清高、中、低劑量組于第15周開始灌胃，按照人的80 g/60 kg，平均1 333 mg/kg，大鼠給藥量為1 333 mg/kg×35/6=7 776 mg/kg，此為一倍劑量。因此，測算后胃萎清高、中、低劑量組給藥濃度（生藥量）分別為15.6 g/kg、7.8 g/kg、3.9 g/kg。 葉酸組第 15 周開始按1.46 mg·kg-1·d-1予葉酸灌胃。灌胃容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃10周。實驗過程中，每2周給各組大鼠測量一次體重，以觀察體重變化情況。

實驗結束后所有大鼠禁食不禁水24 h，用10%的水合氯酸（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，處死大鼠后，取全血，4℃2 000 rpm離心10 min，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。取全胃，沿大彎剪開胃壁，4℃生理鹽水清洗后，取胃竇部組織，10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，用于相關指標的檢測，其余部分胃黏膜層（剔除肌肉層）組織立即置于-80℃低溫冰箱中保存，用于TNF-α、IKK、p50蛋白表達水平檢測。

四、指標檢測方法

1.RT-PCR法檢測胃黏膜組織p50的表達

Trizol試劑盒提取總RNA。取1μg總RNA進行逆轉錄反應，逆轉錄產(chǎn)物取20μL進行PCR反應，同時以GADPH作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法進行結果分析。

根據(jù)指標的條件在GenBank查詢，選取合適的上下游引物，進行PCR反應。

p50引物設計見表1，內(nèi)參Beta actin引物設計見表2。

2.采用Western blot方法檢測TNF-α、IKK和p50蛋白表達水平

五、統(tǒng)計方法

選用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、胃黏膜TNF-α蛋白表達

實驗各組胃黏膜TNF-α蛋白表達水平如表3所示。單因素方差分析結果表明，6組間TNF-α蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結果顯示，模型組TNF-α蛋白表達水平明顯高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。胃萎清高、中、低劑量組與葉酸組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

二、胃黏膜IKK蛋白表達

實驗各組IKK蛋白表達水平見表3。單因素方差分析結果表明，6組間IKK蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組間兩兩比較結果顯示，模型組IKK蛋白表達水平顯著高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組（P＜0.05）；胃萎清高、中、低劑量組與葉酸組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

Western blot顯示，在胃萎清高、中劑量組IKK蛋白表達明顯減少，模型組的表達明顯增多；在胃萎清高、中劑量組TNF-α蛋白表達明顯減少，模型組的表達明顯增多（圖1）。

圖1 Western blot顯示p50、IKK、TNF-α蛋白在各組的表達

三、胃黏膜p50蛋白表達

胃萎清高劑量組的p50蛋白表達水平與模型組相比（P＜0.05），見表3。提示胃萎清高劑量組可能對p50蛋白表達水平有下調(diào)趨勢。

討 論

炎癥反應是機體的主動防御機制，但長期慢性炎癥刺激卻是腫瘤發(fā)生發(fā)展的誘發(fā)因素之一。慢性非可控性炎癥參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移等病理過程[4]，是癌癥的重要發(fā)病機制之一。當機體發(fā)生炎癥反應時，免疫應答細胞能夠釋放炎癥因子。這些因子不僅直接誘導正常細胞中的原癌和抑癌基因突變，使正常細胞發(fā)生癌變；同時它們還促進腫瘤細胞的增殖、抗凋亡、遷移、血管發(fā)生等，使癌癥進一步惡化。由炎癥到癌癥的發(fā)展過程中，有多條炎癥通路的激活，“炎-癌”鏈上，最基本的變化便是各種炎癥因子的激活與表達水平的改變。

表1 p50引物設計

表2 內(nèi)參Betaactin引物設計

表3 各組TNF-α、IKK、p50蛋白表達水平比較 （x±s）

目前，CAG被一致認為是一種癌前疾病，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IKK和p50在胃黏膜的萎縮、腸化生、異型增生甚至是癌變中起到關鍵作用，是CAG發(fā)展成胃癌的重要環(huán)節(jié)。我們的系列研究[5]結合病人所處嶺南地域特點和臨床特征，認為“濕、熱、風、雨”為嶺南主要氣候特點，外邪侵襲，濕熱內(nèi)蘊，久之傷津耗氣，人多體虛，易感外邪，復虛實夾雜，故本病病因主要與“外邪侵襲、飲食傷胃、情緒失調(diào)、體虛久病”有關，基本病機是“脾虛氣滯，熱郁絡瘀”，并貫穿整個病程。課題組經(jīng)過長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)健脾清熱活血法對CAG有一定的臨床療效，但其具體機制尚不明確。中藥對CAG的干預具有一定特色與優(yōu)勢，既往國內(nèi)相關臨床研究證實中醫(yī)藥可在一定程度上改善腺體萎縮、抑制腸上皮化生，但仍需更多嚴格設計的隨機雙盲對照試驗來驗證。本研究通過觀察CAG大鼠胃黏膜病理改變以及對 “炎-癌鏈”相關因子TNF-α、IKK及p50的變化，探討并試求揭示健脾清熱活血中藥對CAG的作用機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃萎清可在一定程度上抑制TNF-α的表達，對炎癥的發(fā)生起到一定的抑制作用。這是因為，TNF-α主要由細胞、單核吞噬細胞分泌。TNF-α除了具有直接溶解腫瘤細胞活性外，亦是具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，能誘導MHC抗原表達，刺激單核細胞、巨噬細胞前體細胞分化，活化多形核白細胞，具有抗體依賴性細胞介導的細胞毒效應，誘導IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子的合成與分泌。眾多的研究顯示[6-7]，TNF-α參與了部分胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。在動物實驗中，腫瘤誘導劑TPA等可誘導多個器官出現(xiàn)TNF-α基因表達增加[8]。有研究表明[9]，TNF-α可以增強胃黏膜血管的通透性與上皮細胞的反應性，促使血管出血、壞死，導致胃黏膜血供欠佳，不利于胃黏膜損傷的修復，從而加劇了胃黏膜的炎癥發(fā)生和發(fā)展，造成胃黏膜損傷加重。而胃萎清通過抑制TNF-α的表達，從而間接抑制炎癥的發(fā)生。

模型組IKK蛋白表達水平明顯高于胃萎清高、中、低劑量組及空白組，且胃萎清高、中、低劑量組IKK的表達水平與空白組相當，提示胃萎清能在一定程度上能抑制炎癥因子的表達，從而阻斷炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。這主要是因為，IKK能參與由細胞因子引起的細胞內(nèi)免疫反應。IKK的激活使IκB被磷酸化，IκB從NF-κB上脫落并被泛素化，使得NF-κB由抑制狀態(tài)被激活，活化的NF-κB轉移至細胞核中從而介導一系列的炎癥反應。而胃萎清通過抑制TNF-α的表達，從而抑制炎癥的發(fā)生。胃萎清高劑量組的p50蛋白表達水平與模型組相比，提示胃萎清高劑量組對p50蛋白表達水平有下調(diào)趨勢。而p50為NF-κB1，可促使NF-κB入核，激活基因轉錄，從而導致炎癥反應，據(jù)此推測較高劑量的胃萎清可能通過抑制炎癥反應發(fā)揮其藥理學作用。

此外，本研究還提示，胃萎清中、低劑量組較模型組無明顯下降趨勢，可能與藥物濃度有關，或與通路因子的交叉對話有關，仍需要課題組下一步加大樣本量后進行更多、更有益、更深入的研究及探討。綜上所述，可以初步認為在蛋白表達水平層面，胃萎清能使NF-κB炎癥通路的致炎因子TNF-α、IKK、p50的表達水平下降從而控制CAG的發(fā)展，但其機制及量效關系有待進一步研究印證。

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