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(浙江理工大學生命科學學院，杭州 310018)

0　引　言

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)為天南星科藥用植物，其塊莖經(jīng)炮制干燥可入藥，性溫味辛，具有降逆止嘔、燥濕化痰、消痞散結(jié)的功效，是我國傳統(tǒng)治痰止吐中藥[1]。Ca2+是半夏生長必需的營養(yǎng)元素之一，植物體內(nèi)Ca2+正常濃度維持在0.1%～5.0%，因此保證植物體內(nèi)正常的鈣濃度才能使維持植物體的生長發(fā)育[2]。正常情況下，缺鈣是很少見的，但是在植物生長發(fā)育過程中，高鹽、高溫或低溫、土壤水分不良和根系活力不高等不良環(huán)境因素的影響都會導致植物鈣素吸收不足。在逆境環(huán)境中，植物體需氧代謝會加快，從而產(chǎn)生一系列過多的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)，損害細胞膜，加劇細胞氧化衰老，破壞植物體內(nèi)微平衡[3]。植物抗逆境生理生化等分子調(diào)控機制發(fā)揮自我保護作用，產(chǎn)生一系列清除逆境脅迫產(chǎn)生的過多ROS的保護酶，如過氧化物酶(Peroxidase, POD)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)等[4]。逆境對植物的傷害通過膜脂的過氧化生成過氧化物，從而對植株產(chǎn)生傷害，如丙二醛(Malondialdehyde, MDA)等[5]。因此深入探究鈣離子對半夏的生理特性的影響，對于不良環(huán)境下半夏的抗逆性的提高能提供科學依據(jù)。

植物對逆境的應答反應有Ca2+參與，胞外Ca2+要穿過質(zhì)膜進入胞內(nèi)起作用[6]。Gong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+濃度處理對玉米幼苗的耐熱性有明顯增強作用，植物細胞感受并傳導逆境刺激信號的明顯變化是胞質(zhì)中Ca2+濃度發(fā)生變化。李燦雯等[8]認為植物的抗氧化系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)Ca2+濃度來提高其抗逆性，而且Ca2+對提高葉綠體的活性具有重要作用。Ca2+在光合電子傳遞發(fā)揮重要作用，不僅可以增強能量在捕光色素或反應中心之間的傳遞，還可以使放氧核心復合物的熒光發(fā)射強度增加[9]。此外，鈣離子能促進PSII潛在活性保持較高水平[10]，因此適當提高植株的鈣水平可以促進葉片的光合作用。

為了獲得半夏鈣肥的最適施用濃度范圍，本文通過研究在不同濃度的氯化鈣溶液作用下半夏葉片生理和代謝響應的差異，探討Ca2+對半夏生理酶活性、光合作用參數(shù)、葉綠素熒光參數(shù)等生理生化因素的影響，為半夏的種植優(yōu)化、提高品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

本實驗材料為三葉半夏(P.ternata)，選擇大小相近、形態(tài)一致的塊莖為繁殖材料，材料取自湖北襄陽地區(qū)。采用盆栽(14 cm×15 cm)栽種，用蛭石作栽培基質(zhì)，Hoagland-Arnon基本營養(yǎng)液澆施每盆基質(zhì)，每盆定植15株，置于實驗室遮陽棚內(nèi)。Hoagland-Arnon完全營養(yǎng)液配方作為大量元素和微量元素配方，其中用KNO3代替Ca(NO3)2，pH值調(diào)至6.0。當每盆半夏植株葉片完全展開時，大致高8～10 cm左右，在基本營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，用CaCl2作外源鈣處理，設計6個不同水平(0、200、400、600、800 mg/L和1000 mg/L)濃度處理，每個處理3盆。每隔5 d噴施200 mL于葉面，直至半夏倒苗，在全苗期各處理中每盆挑選10株生長良好，長勢一致的成熟植株，取其中間葉片進行光合指標和生理指標測定，重復3次。

1.2　相關(guān)指標測定方法

1.2.1生理酶活指標測定

SOD活性根據(jù)梁愛華等[11]氮藍四唑光氧化還原法測定，POD活性根據(jù)袁慶華等[12]愈創(chuàng)木酚顯色法測定，紫外吸收法測定CAT活性參考文獻[13]，MDA含量參照高俊鳳[5]硫代巴比妥酸顯色法測定。

1.2.2葉綠素含量測定

取半夏新鮮葉片，將葉片清洗干凈，除去葉片中脈部分并剪碎混勻。稱取0.2 g混勻的新鮮葉片，稱3份，放入研缽中，加少量液氮磨碎，再加入2 mL 80%丙酮，研磨成勻漿，裝入2 mL離心管，靜置至組織變白。再過濾到25 mL試管中，用丙酮定容至25 mL，采用分光光度計法測定葉綠素含量，在721分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)測定溶液在波長663、645 nm下的吸光度[14]，用80%丙酮溶液為空白對照，測定吸光度值的計算按照參考文獻[15]，葉綠素a和葉綠素b含量可用公式表示為：

Ca=12.7×OD663-2.69×OD645,

Cb=22.9×OD645-4.68×OD663,

其中：C為葉綠體色素的濃度，mg/L；OD為吸光度值；12.70、2.69、22.90和4.68系數(shù)為比吸收系數(shù)；Fw為鮮重，g；VT為提取液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.3葉綠素熒光參數(shù)測定

夜晚將待測樣品放入暗室暗處理30 min，利用超便攜式調(diào)制葉綠素熒光儀(Mini-PAM，上海澤泉科技股份有限公司)按照預先編好的程序測定，選取生長良好的葉片測定電子傳遞速率(Electron transfer rate,ETR)、光化學猝滅系數(shù)(Photochemical quenching,qP)、光合量子產(chǎn)量(Photosynthetic quantum yield,Yield)和非光化學猝滅系數(shù)(Non-photochemical quenching,qN)等，選取長勢一致的葉片重復3次實驗，取3次數(shù)據(jù)的平均值分析。

1.2.4光合作用參數(shù)測定

挑選天氣晴朗的晴天，于上午9:00—12:00，利用Li-6400便攜式光合儀(上海澤泉科技股份有限公司)測定葉片的凈光合速率(Photosynthesis,Pn)、蒸騰速率(Transpiration rate,Tr)、氣孔導度(Stomatal conductance,Gs)和胞間二氧化碳濃度(Intercellular carbon dioxide concentration,Ci)等參數(shù)，設定儀器溫度30 ℃，光量子通量密度為800 μmol/(m2·s)，CO2濃度380 μmol/mol，選取長勢一致的葉片重復3次實驗，取3次數(shù)據(jù)的平均值分析。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤進行表示，平均值之間的統(tǒng)計學意義是由Duncan的多個范圍的測試評估(p≤0.05作為顯著性)。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和方差檢驗用Excel 2013和SPSS 17.0，并用Origin 8.0進行繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同鈣濃度對葉片生理酶活性的影響

圖1(a)為不同Ca2+濃度對半夏葉片SOD活性的影響，結(jié)果表明：Ca2+對半夏葉片中SOD活性影響顯著；在Ca2+濃度為0、200、1 000 mg/L時，SOD活性均較低。由圖1(a)可知，鈣濃度的升高導致半夏葉片中SOD活性隨之呈先升后降的趨勢，600 mg/L濃度時最高，但是當Ca2+濃度為1 000 mg/L時SOD活性卻較低。這表明鈣離子濃度并不是越高越好，高濃度的鈣鹽處理會抑制酶的活性，只有適宜的Ca2+濃度能提高半夏葉片中SOD的活性。圖1(b)為不同Ca2+濃度對半夏葉片POD活性的影響，圖1(b)顯示，Ca2+處理的實驗組，葉片中POD活性明顯升高，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。POD活性在Ca2+濃度為600mg/L時達到最大，但過高濃度的Ca2+會抑制半夏葉片內(nèi)的POD活性。圖1(c)為不同Ca2+濃度對半夏葉片CAT活性的影響，結(jié)果表明：半夏葉片中CAT活性隨著Ca2+濃度的升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，Ca2+對半夏葉片CAT活性影響明顯。由圖1(c)可知，當Ca2+濃度為600 mg/L時，CAT活性最高。圖1(d)為不同Ca2+濃度對半夏葉片MDA含量的影響，由圖1(d)可知，MDA的含量隨著Ca2+濃度的增加而呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢，Ca2+處理明顯降低半夏葉片中MDA含量，其中MDA含量在Ca2+濃度為600 mg/L時最低，但是高濃度的鈣處理MDA的含量升高，表明高濃度的鈣處理不能改善膜脂過氧化，適宜濃度的Ca2+處理可以降低半夏葉片中MDA的含量，降低膜氧化程度，穩(wěn)定生物膜[16]，提高半夏的抗逆性。

圖1　不同Ca2+濃度對葉片生理酶活性的影響

2.2　不同鈣濃度對葉片葉綠素含量的影響

圖2為不同鈣處理下葉綠素含量的變化，由圖2可知Ca2+濃度為200～1000 mg/L處理與對照相比均提高葉綠素a、b含量及葉綠素總量，當Ca2+濃度為600 mg/L時，葉綠素含量明顯高于其他處理組，因此適當提高Ca2+濃度明顯提高葉綠素a/葉綠素b比值，葉綠素a/葉綠素b比值高低反映植株維持光合系統(tǒng)的協(xié)調(diào)性的強弱，是植物對逆境適應的一種表現(xiàn)[17]。

圖2　不同Ca2+濃度對葉片葉綠素含量的影響

2.3　不同鈣濃度對葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

圖3為不同鈣處理下葉片熒光參數(shù)變化，由圖可知不同鈣處理的葉綠素熒光參數(shù)存在比較明顯的差異。由圖3(a)可知，Ca2+處理可提高半夏葉片的實際光合效率，電子傳遞速率(ETR)隨光照強度(PAR)的增加均呈上升趨勢,600 mg/L的鈣處理明顯高于其他處理組。圖3(b)顯示，非光化學淬滅系數(shù)(qN)隨著鈣處理有所下降，至600 mg/L時達最低，qN值的降低說明更多的光能被用于CO2固定；光化學猝滅系數(shù)(qP)隨光強的變化規(guī)律如圖3(c)，在不同鈣處理下，qP在低光強條件下降低很快，隨著光強的增加，qP降低速率顯著減緩，由圖3(c)可知600 mg/L濃度下qP值較好。Yield表示PSII的實際光化學效率，圖3(d)表明隨著光強的升高，600 mg/L鈣處理下降速度最慢，且都高于其他實驗組。

圖3　不同Ca2+濃度對葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.4　不同鈣濃度對葉片光合參數(shù)的影響

表1為不同鈣濃度對葉片光合參數(shù)的影響，由表1可知鈣處理卻使Pn升高，600 mg/L濃度處理是對照0 mg/L濃度的2.27倍，對照的胞間CO2最高，400、600、800 mg/L鈣處理對比對照組Ci下降顯著，與Ci相反，一定濃度Ca2+處理顯著降低氣孔導度，Ca2+處理下氣孔較對照有一定程度的關(guān)閉，鈣處理在高溫下提高光合速率并非氣孔因素，反而能對高溫下的葉片有一定的保護作用；低濃度的Ca2+處理與對照相比差異顯著，高濃度的Ca2+處理降低氣孔導度，蒸騰作用也有所降低，在600 mg/L濃度Ca2+處理下，顯著提高葉片的凈光合速率，胞間CO2濃度明顯降低，同時蒸騰作用顯著增強。

表1　不同Ca2+濃度對葉片光合參數(shù)的影響

注：同系列數(shù)據(jù)后的不同字母分別表示在0.05水平上顯著差異。

3　討　論

一定濃度的鈣處理能提高半夏的SOD活性，但過高濃度鈣處理反而抑制SOD活性，并且600 mg/L濃度的鈣處理能促進超氧化物歧化酶的活性；POD是普遍存在于植物體內(nèi)，并且活性較高的一種重要保護酶，主要清除細胞內(nèi)的H2O2，參與以H2O2或有機過氧化物為還原劑的各種氧化反應，與植物的呼吸作用、光合作用、生長素的氧化以及木質(zhì)素的形成密切相關(guān)[5]，通過氧化還原反應將H2O2還原為H2O，從而使細胞組織組織免受破壞。此外POD活性隨植物生長發(fā)育進程以及環(huán)境條件的改變而變化，因此POD活性可以反應植物體內(nèi)的代謝及抗逆性的變化。在本實驗中，400～600 mg/L濃度范圍內(nèi)，半夏的POD活性維持一個較高水平，600 mg/L濃度處理最好；CAT是植物體內(nèi)重要的保護酶之一，是以一種鐵卟啉為輔基的酶類清除劑，能協(xié)同SOD、POD迅速清除代謝中產(chǎn)生的H2O2，緩解膜脂過氧化[24]。MDA是膜脂過氧化重要的產(chǎn)物之一，其含量反映膜脂過氧化的程度[25]，常結(jié)合蛋白質(zhì)導致蛋白質(zhì)偶聯(lián)從而損害細胞膜，其含量反映細胞膜脂過氧化程度，因此可以通過測定MDA含量了解膜系統(tǒng)受損程度。本文中，Ca2+處理降低半夏葉片MDA的積累，MDA含量越低表示植株生長旺盛，實驗結(jié)果顯示600 mg/L濃度的鈣處理下MDA含量較低，有助于緩解膜脂過氧化。

葉綠素熒光參數(shù)在植物生化過程中的變化可以與ATP合成、CO2固定、電子傳遞等過程緊密聯(lián)系起來，反應植物葉片光化學反應效率的高低、吸收光能的多少，激發(fā)能傳遞的強弱等光合作用一系列的原初反應過程，直接反映植物生長狀況[26]。葉綠素含量是反映植物光合能力的重要指標之一，有研究發(fā)現(xiàn)光合色素容易受到活性氧的破壞，Ca2+可通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)清除活性氧來保護[27]。葉綠素a/葉綠素b比值反映類囊體膜垛疊程度，對同一植物而言，葉綠素a/葉綠素b比值直接反映植物對光量子的有效吸收、傳遞和利用，以及葉片光化學效率的高低[28]。本研究結(jié)果表明，600 mg/L濃度處理增強了半夏葉片光合色素的穩(wěn)定性，Ca2+處理提高a/b比值，進一步證實Ca2+可能通過結(jié)合膜表面上的磷酸鹽、磷酸酯以及蛋白質(zhì)的羥基保持膜結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定性[29]。葉綠體類囊體膜上的光化學反應中心的光能轉(zhuǎn)換效率隨著鈣處理濃度的升高而升高，但鈣處理濃度過高又會抑制光合轉(zhuǎn)換效率；qP指由光合作用引起的熒光淬滅，反映植物光合活性的高低以及PSⅡ反應中心的開放程度，其中PSⅡ天線色素吸收光能后，用于光合作用的電子傳遞[30]，qN反映植物熱耗散的能力的變化，600 mg/L濃度Ca2+處理下qN較低；qP在600 mg/L濃度處理下卻較高，這表明適宜的鈣處理會增大PSⅡ反應中心開放程度，增強PSⅡ電子傳遞活性，同時PSII反應中心光電子傳遞能量占所吸收光能的比例明顯增強，ETR也有所增強[31]。

光合作用效率的高低直接決定植物生長發(fā)育，探討影響植物光合速率的因素對促進植物生長發(fā)育至關(guān)重要[32]。胡龍嬌等[33]在研究光質(zhì)對半夏組培苗的生理特性和光合特性影響時發(fā)現(xiàn)氣孔因素和非氣孔因素都對葉片光合速率有影響，葉肉細胞氣體擴散阻抗，CO2的溶解度，Rubiso對CO2的親和力都是影響葉片光合速率的關(guān)鍵因素[34]。葉片光合速率是由氣孔因素和非氣孔因素兩個方面共同影響，溫度對葉片光合速率影響顯著。已有研究表明，依據(jù)Pn，Ci，Gs的變化方向可以判斷光合速率變化的影響因素，在高溫環(huán)境下光合作用受到抑制并非氣孔因素，可能是葉片氣孔關(guān)閉導致葉肉細胞氣體擴散阻抗增加[35]，CO2的溶解度下降，葉肉細胞同化能力降低，Rubiso酶對CO2的親和力降低，光合中心關(guān)鍵成分的熱穩(wěn)性降低[36]。楊衛(wèi)星等[9]認為Ca2+處理能增加葉片氣孔限制值，可以維持氣孔正常開閉的能力。本文中隨著Ca2+濃度提高，Gs、Tr降低，這表明Ca2+在一定程度上降低半夏的氣孔導度，使氣孔有所關(guān)閉；Pn卻升高，表明Ca2+提高光合速率并非氣孔因素；600 mg/L濃度Ca2+處理下，Pn顯著增強，伴隨著Ci降低和Tr增強，這表明該濃度處理下能顯著提高半夏光合作用。

4　結(jié)　論

在植物細胞中，Ca2+作為重要的胞內(nèi)第二信使之一，能在逆境脅迫下對植物的生長發(fā)育起調(diào)控作用；當植物體處在逆境脅迫的情況下，鈣調(diào)節(jié)通道調(diào)控植物體內(nèi)生理生化過程，影響植物對環(huán)境的適應。本實驗通過研究在不同濃度的CaCl2溶液作用下半夏葉片生理和代謝響應的差異，得到以下結(jié)論：

a) 鈣離子對半夏POD、CAT、SOD三種酶活性有促進作用，當Ca2+濃度逐漸升高時，三者活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，至600 mg/L濃度時三種酶活性最高，且此時MDA含量較低。

b) 隨著Ca2+濃度升高明顯提高了葉綠素含量，同時ETR、Yield和qP呈先升后降的趨勢，qN呈先降后升趨勢；600 mg/L Ca2+濃度處理顯著提高葉片的Pn和Tr，降低胞間Ci。因此，鈣離子提高保護酶活性和葉綠素含量，進而促進新陳代謝，改善光合作用，對提高半夏的抗逆性有著重要的調(diào)節(jié)作用。