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(浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)

0　引　言

生物傳感器是(Biosensor)是一種通過信號轉(zhuǎn)換器將化學(xué)物質(zhì)、熱、光等信號轉(zhuǎn)換成可以被接收的電信號，從而達到特定識別信號的儀器，它普遍被應(yīng)用于生物物質(zhì)的濃度檢測[1]。與目前普遍應(yīng)用的分析方法相比，如吸附溶出伏安法、高效液相色譜法和毛細管電泳法，生物傳感器具有選擇性高、靈敏度高、分析速度快、檢測限低、價格低廉和可重復(fù)利用等特點[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，酶生物傳感器吸引越來越多學(xué)者的興趣，對其的探索研究也進一步加深。酶生物傳感器的工作電極因需要與酶結(jié)合，而具有小尺寸效應(yīng)、大比表面積、生物相容性好的納米材料可以固定更多的酶而不影響其活性，使得這類納米材料在生物傳感器中具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。隨著人們對納米材料的探索越來越多，納米材料在酶生物傳感器領(lǐng)域中的應(yīng)用也變得越來越重要[4]。

羥基磷灰石(Hydroxyapatite， HAP)是脊椎動物骨骼和牙齒的主要無機組成成分，具有良好的生物活性，生物相容性，無毒、無害和無致癌作用[5-6]；較強的吸附性可以固定分子識別元件；大的比表面積，獨特的多吸附位點，可為酶的固定提供較大的結(jié)合位點，因而廣泛的應(yīng)用在生物工程領(lǐng)域，近年來在生物傳感器方面的應(yīng)用也越來越普遍[7]。石墨烯(Graphene)是一種只有一個碳原子層厚度的準二維材料[8]，具有比表面積大、化學(xué)穩(wěn)定性好和電化學(xué)性能優(yōu)異的特點，是制作生物傳感器的理想材料[9-10]，廣泛應(yīng)用于電化學(xué)研究領(lǐng)域。納米金(Au nanopaticles， AuNPs)又稱膠體金，除具有比表面積大、比表面反應(yīng)活性高、有宏觀量子隧道等納米材料共有的性質(zhì)外，還具有良好的親水性能，能與多種生物大分子結(jié)合并保持其生物活性，因而被廣泛應(yīng)用于傳感器的制備[11-12]。

抗壞血酸(Ascorbic acid)存在于大多數(shù)的生物體內(nèi)，是一種由生物體正常代謝產(chǎn)生的維生素[13]?？箟难釢舛仍谏矬w內(nèi)處于一定的濃度范圍，濃度過高或過低都會導(dǎo)致人體疾病的產(chǎn)生，最為常見的就是維生素C缺乏導(dǎo)致的壞血病[14]。目前常見的抗壞血酸的檢測方法有比色法、紫外分光光度法和高效液相色譜法[15-17]等，但這些方法都存在許多缺點，如分光光度法易受外界干擾的影響，色譜法設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，因此，酶生物傳感器法憑借其操作簡單、靈敏度高、酶促反應(yīng)專一等優(yōu)點成為眾多專家學(xué)者努力的目標[18]。本文利用水熱法制備出羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料，利用該復(fù)合材料作為工作電極制備抗壞血酸生物傳感器測定抗壞血酸濃度。

1　實　驗

1.1　實驗試劑與儀器

氯化鈣(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)購自杭州米克化工儀器有限公司，氯金酸(1 g)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，抗壞血酸氧化物酶(400 units/mg)購自Sigma公司，L-抗壞血酸(25 g)購自中國試劑網(wǎng)。

電化學(xué)實驗在CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華)進行，電化學(xué)實驗采用三電極系統(tǒng)，復(fù)合材料修飾的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑網(wǎng)電極為對電極。

1.2　膠體金的制備

在500 mL帶有冷凝裝置的圓底燒瓶中加入250 mL的濃度為1.0 mmol/L的氯金酸溶液，在溫度為120 ℃的水浴鍋中加熱至沸騰狀態(tài)，過程中不斷伴隨磁力攪拌，并迅速將濃度為38.8 mmol/L的檸檬酸鈉溶液25 mL倒入三口圓底燒瓶中，持續(xù)加熱并攪拌10 min，過程中溶液顏色由明黃色轉(zhuǎn)為深紫紅色，停止加熱繼續(xù)攪拌15 min至溶液冷卻到室溫后，用孔徑為0.8 μm的過濾膜過濾，得到的濾液即為膠體金[19]。

1.3　羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨稀/納米金復(fù)合材料的制備

取60 mmol/L的磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液和100 mmol/L的氯化鈣(CaCl2)溶液各30 mL，在15 ℃條件下預(yù)冷1 h后迅速混合，在攪拌狀態(tài)下加入5 mL濃度為4 mg/ml的氧化石墨烯溶液和5 mL上述制備的膠體金溶液，用1 M的鹽酸快速調(diào)節(jié)pH值至4.5，繼續(xù)在15 ℃下靜置1 h。然后倒入100 mL的帶有聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在140 ℃下反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，抽濾，在60 ℃下烘干[20]，即得到黑色的羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨稀(Reduced graphene oxide， RGO)/納米金復(fù)合材料。

1.4　修飾電極的制備

分別用直徑為0.50 μm和0.05 μm的氧化鋁粉末，在麂皮上打磨玻碳電極(Glassy carbon electrode， GCE)至表面光滑形成鏡面，用去離子水將電極上殘留的氧化鋁粉末沖洗干凈，然后按順序?qū)⒃揋CE放入去離子水、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10 min，并在1.0 mol/L的硫酸溶液中用循環(huán)伏安掃描法活化20圈，活化范圍為-1.0～1.0 V，接著在0.2 mol/L的鐵氰化鉀溶液中掃描檢測峰電位差，最后用去離子水沖洗備用[21]。

將上述制備的羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料粉末100 mg，加入2 mL的PBS中，制成濃度為50 mg/mL的溶液并超聲1 min，用10 μL的移液槍移取該溶液滴涂在處理好的玻碳電極表面，在60 ℃的條件下烘干，反復(fù)重復(fù)三次后，再用5 μL的移液槍移取5微升復(fù)合材料滴加在玻碳電極表面，烘干。稱取2 mg的抗化血酸酶，溶解在20 μL的PBS溶液中，配置成濃度為40 units/μL的抗壞血酸氧化酶溶液，取12 μL的酶溶液，按上述方法滴涂到處理好的玻碳電極表面，烘干，待用[22]。

1.5　實驗方法

電化學(xué)實驗采用三電極系統(tǒng)：抗壞血酸氧化酶和復(fù)合材料修飾的玻碳電極為工作電極，鉑網(wǎng)電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極[23]。以磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉為原料配置成的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為底液，通入并保持氮氣，在室溫下進行實驗。

2　結(jié)果與討論

2.1　電極修飾材料的形貌表征

為了研究在溫度為15 ℃、反應(yīng)時間12 h和pH值為4.5的條件下利用水熱法制備出的電極修飾材料羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)和形貌，對該復(fù)合電極材料進行掃描電鏡(SEM)分析和透射電鏡(TEM)分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可以看出該復(fù)合膜材料表面平整，表明羥基磷灰石納米線與氧化還原石墨烯很好的復(fù)合在一起，同時納米金顆粒均勻的散落在復(fù)合材料表面。圖1(b)顯示羥基磷灰石納米線交叉的穿插在氧化還原石墨烯薄膜中間，并且納米金顆粒沒有出現(xiàn)團聚現(xiàn)象。綜上所述，羥基磷灰石納米線、還原氧化石墨烯和納米金顆粒均勻的復(fù)合在一起。

圖1　羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料的電鏡照片

2.2　不同材料修飾的玻碳電極對抗壞血酸的響應(yīng)

為了考察復(fù)合材料中每種材料的作用，本實驗將羥基磷灰石納米線、羥基磷灰石納米線/納米金、羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨稀、羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨稀/納米金四種材料修飾的工作電極以及裸玻碳電極，分別對濃度為0.2 mmol/L的抗化血酸溶液利用循環(huán)伏安法進行了檢測，結(jié)果如圖2所示。實驗結(jié)果表明：HAP/AuNPs/RGO材料修飾的玻碳電極對相同濃度的抗化血酸具有最大的電化學(xué)響應(yīng)，HAP/RGO對抗壞血酸的響應(yīng)能力明顯低于HAP/AuNPs，但高于GCE、HAP/AuNPs和HAP，這是由于RGO具有很強的導(dǎo)電性能，RGO修飾的電極可以快速并且靈敏的對抗壞血酸作出電化學(xué)響應(yīng)，而AuNPs除了具有較高的導(dǎo)電性能外還具有較好的電催化活性，所以使得HAP/AuNPs/RGO的性能要優(yōu)于HAP/RGO；HAP/AuNPs和HAP兩種材料對抗化血酸的響應(yīng)性與裸玻碳電極GCE幾乎一樣，甚至低于GCE，這是由于HAP的導(dǎo)電性能差，使得其與裸玻碳電極相比對抗化血酸的響應(yīng)能力降低，由圖2中可以看出HAP的響應(yīng)能力最低也證明了這一點。因此，本實驗選擇HAP/AuNPs/RGO作為最優(yōu)的電極修飾材料。

圖2　五種不同材料修飾電極對濃度為0.2 mmol/L抗壞血酸的電化學(xué)響應(yīng)

2.3　材料負載量對電化學(xué)性能的影響

為了考察工作電極表面修飾納米材料的負載量與響應(yīng)電流之間的關(guān)系，本實驗在掃描范圍、掃描速率、溫度等條件不變的情況下僅僅改變納米復(fù)合材料的負載量，通過循環(huán)伏安掃描法得出了對應(yīng)的峰值響應(yīng)電流，實驗結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：隨著材料負載量的增加，響應(yīng)電流也隨之變大，但當材料負載量到達35 μL時響應(yīng)電流達到最大值，繼續(xù)增加材料負載量響應(yīng)電流反而減小，其原因可能是當材料過多時玻碳電極上形成過厚的復(fù)合材料膜，將該電極插入底物溶液中時容易造成材料脫落的現(xiàn)象，從而使實際電極負載量減小。

圖3　材料負載量與電流響應(yīng)關(guān)系圖

2.4　掃描速率對峰值電流響應(yīng)性的影響

在材料負載量、抗壞血酸濃度、掃描范圍等條件不變的情況下改變掃描速率從而考察掃描速率對峰值電流的影響，結(jié)果如圖4所示。圖4(a)即為在八個不同掃描速率下修飾工作電極對抗壞血酸電流響應(yīng)性的CV圖，由圖可知隨著掃描速率的增大修飾電極的電流響應(yīng)也隨之增大，抗壞血酸的峰電位向右略有偏移但基本保持不變。圖4(b)為峰電流與掃描速率線性相關(guān)圖，由圖可知：峰值電流與掃描速率的平方根成線性關(guān)系，其回歸方程為y=5.304×10-4x+4.317×10-5，線性相關(guān)度R2為0.991。

圖4　掃描速率對峰值電流響應(yīng)性影響

2.5　抗壞血酸生物傳感器的電化學(xué)響應(yīng)

為了考察該抗壞血酸氧化酶生物傳感器對抗壞血酸的響應(yīng)性能，本實驗記錄在濃度范圍為3.90×10-4～3.60×10-2mol/L的抗壞血酸溶液中以羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金顆粒/抗壞血酸氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極的抗壞血酸氧化酶生物傳感器對抗壞血酸的電流響應(yīng)CV圖(圖5所示)。圖5(a)中考察傳感器對17個不同濃度梯度的抗壞血酸溶液的電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果表明隨著抗壞血酸溶液濃度的增大，峰值電流也在不斷增大，并且呈現(xiàn)線性相關(guān)(圖5(b))，抗壞血酸濃度與響應(yīng)電流的相關(guān)性可達R2=0.998 5，由圖5(b)可以得出該抗壞血酸氧化酶傳感器的檢出限為3.39×10-6mol/L(S/N=3)，靈敏度為1.594 9×10-2A/moL。與目前已報道的抗壞血酸傳感器相比該抗壞血酸酶傳感器具有較高的靈敏度、較大的線性檢測范圍和較低的檢出限(表1)，從表1可以明顯的看出羥基磷灰石/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料作為電極修飾材料具有較大的線性檢測范圍，范圍上限可達3.60×10-2mol/L，明顯高于雞蛋膜/殼聚糖、聚臨苯二胺和納米氧化鐵三種材料；檢出限也顯著低于L-精氨酸和雞蛋膜/殼聚糖。

圖5　響應(yīng)電流與底物濃度的關(guān)系圖

材料線性檢測范圍/(mol·L-1)檢出限/(mol·L-1)參考文獻L-精氨酸1.0×10-5～1.0×10-26.71×10-6[24]雞蛋膜/殼聚糖2.0×10-5～8.2×10-41.20×10-5[25]聚鄰苯二胺2.5×10-7～1.0×10-41.0×10-8[15]納米氧化鐵1.0×10-6～1.0×10-38.9×10-7[16]羥基磷灰石/還原氧化石墨烯/納米金3.90×10-4～3.60×10-23.39×10-6本文

2.6　干擾物質(zhì)對響應(yīng)性的影響

通常破壞抗壞血酸的安培檢測的原因是可能存在干擾物檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖和尿酸，所以為了考察該抗化血酸氧化酶生物傳感器的抗干擾性能，本實驗考察了檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、尿酸在該生物傳感器對抗壞血酸檢測過程中的干擾作用。本實驗利用電流時間法往PBS溶液中按下列順序依次加入抗化血酸(2.50 mmol/L)、檸檬酸鈉(0.20 mmol/L)、葡萄糖(5.00 mmol/L)、蔗糖(0.10 mmol/L)、尿酸(0.20 mmol/L)和抗壞血酸(6.25 mmol/L)記錄安培i-t曲線，結(jié)果如圖6所示。在第一次加入抗化血酸時產(chǎn)生了非常明顯的電流響應(yīng)，而隨后檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖、尿酸的添加并沒有引起明顯的電流響應(yīng)，只有尿酸存在輕微的電流波動，但這種電流波動與抗化血酸的電流響應(yīng)相比并不明顯，最后添加的抗壞血酸又引起非常明顯的電流響應(yīng)。實驗結(jié)果表明，這些干擾物質(zhì)并未對抗壞血酸產(chǎn)生明顯的干擾響應(yīng)，因此該傳感器可以在干擾物質(zhì)存在的情況下較好選擇性地檢測抗壞血酸。

圖6　干擾物質(zhì)對抗壞血酸干擾的電流響應(yīng)的影響

2.7　抗壞血酸氧化酶生物傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性實驗

在最佳制備和實驗條件下進行重現(xiàn)性實驗：用所制備的抗壞血酸氧化酶傳感器對濃度為1.00×10-2mol/L的抗壞血酸標準溶液進行6次平行測定，所測結(jié)果如表2所示，實驗結(jié)果表明所測標準偏差為3.9%(RSD<4%)，實驗證明該抗壞血酸氧化酶生物傳感器具有優(yōu)異的重現(xiàn)性。

表2　抗壞血酸酶生物傳感器對抗壞血酸的重現(xiàn)性實驗

為了考察該傳感器的穩(wěn)定性，在各項實驗參數(shù)不變的條件下將羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金顆粒/抗壞血酸氧化酶修飾的玻碳電極插入濃度為1.00×10-2mol/L的抗壞血酸溶液中循環(huán)掃描10圈，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，第一圈與第二圈的峰值響應(yīng)電流之間存在輕微差異，但從第二圈開始達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著掃圈數(shù)的增加電流響應(yīng)信號有輕微減弱現(xiàn)象，但仍在標準范圍之內(nèi)。這表明該生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖7　連續(xù)循環(huán)掃描10圈后的CV圖

3　結(jié)　論

利用水熱反應(yīng)法一步制備出羥基磷灰石納米線/還原氧化石墨烯/納米金復(fù)合材料，利用該復(fù)合材料修飾玻碳電極后負載抗壞血酸酶膜作為工作電極，建立一種新穎的抗壞血酸氧化酶傳感器，該抗壞血酸氧化酶生物傳感器的靈敏度為1.594 9×10-2A/moL，線性檢測范圍為3.90×10-4～3.60×10-2mol/L，最低檢測限為3.39×10-6mol/L，與已經(jīng)報道過的抗壞血酸氧化酶生物傳感器相比，該傳感器具有更好的靈敏度，更大的線性檢測范圍，更低的檢出限。同時，對該抗壞血酸酶生物傳感器做了抗干擾性實驗和重復(fù)性等試驗，實驗表明該傳感器具有優(yōu)異的抗干擾性能和良好的穩(wěn)定性，表明該方法有望實際應(yīng)用于對抗壞血酸的檢測。