梁梅亭　朱宏　董克禮　李廣誠

摘要：目的 觀察補(bǔ)腎活血針刺法對阿爾茨海默病（AD）模型小鼠SAMP8杏仁核蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)的影響，探尋針刺治療AD的潛在靶點(diǎn)蛋白。方法 30只6月齡雄性SAMP8小鼠隨機(jī)分為針刺組和對照組，每組15只，針刺組選取“腎俞”“百會”“血?！薄半跤帷边M(jìn)行干預(yù)，對照組予以相同時間捉抓刺激。干預(yù)8周后，取杏仁核，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果 與對照組比較，針刺組最終鑒定有9個差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中6個上調(diào)、3個下調(diào)，根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中提供的相關(guān)信息，差異蛋白質(zhì)點(diǎn)功能主要涉及線粒體能量代謝、氧化應(yīng)激、β-淀粉樣蛋白（Aβ）產(chǎn)生等方面。結(jié)論 補(bǔ)腎活血針刺法可調(diào)節(jié)杏仁核內(nèi)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，提示其可能是通過改善線粒體能量代謝、抗氧化應(yīng)激、減少Aβ產(chǎn)生等來實(shí)現(xiàn)對AD的潛在治療作用。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；補(bǔ)腎活血；針刺；SAMP8小鼠；杏仁核；蛋白質(zhì)組學(xué)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.013

中圖分類號：R245 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）03-0058-06

Abstract： Objective To observe the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on amygdaloid protein expression in SAMP8； To explore the potential target protein for acupuncture treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Thirty six-month-old male SAMP8 mice were randomly divided into acupuncture group and control group， 15 mice in each group. Acupuncture group selected Baihui （GV20）， Shenshu （BL23）， Geshu （BL17） and Xuehai （SP10） to intervene. The control group was given the same time to catch and stimulate. After 8 weeks， the amygdala was extracted and the differential expression protein spots were identified by proteomic techniques. Results Compared with control group， acupuncture group eventually identified 9 differential expression protein spots， of which 6 up-regulated and 3 down-regulated. According to the relevant information provided in the protein database， the main function of differential expression proteins involved in the mitochondrial energy metabolism， oxidative stress， and production of Aβ. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can regulate multiple protein expressions in amygdala， suggesting that it may be through improving mitochondrial energy metabolism， oxidative stress， reducing production of Aβ to realize the potential therapeutic effects on AD.

Keywords： Alzheimer disease； Bushen Huoxue； acupuncture method； SAMP8 mice； amygdala； proteomics

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是最常見的癡呆類型之一，也是最常見的神經(jīng)變性疾病，以記憶力減退、認(rèn)知功能障礙及人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，其病理特征是β-淀粉樣蛋白（Aβ）腦內(nèi)異常沉積形成的老年斑、Tau蛋白過度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元的廣泛丟失。AD具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，在AD中，杏仁核是最容易受累，也是Aβ最早沉淀的部位之一[1-2]，磁共振也發(fā)現(xiàn)AD患者杏仁核以每年3.79%的速度萎縮[3]，與此同時，杏仁核體積的下降與認(rèn)知功能損害有關(guān)[4-5]。SAMP8小鼠是日本竹田俊男教授經(jīng)過20代以上的近親交配形成遺傳背景和老化特征穩(wěn)定的模型，表現(xiàn)快速老化癥狀[6]，它在早期階段就開始出現(xiàn)為與年齡相關(guān)的記憶力和學(xué)習(xí)能力的下降[7]，AD的癥狀和特征性病理表現(xiàn)如Aβ沉積、tau蛋白異常磷酸化和神經(jīng)元的損失也已證實(shí)在SAMP8小鼠中同樣存在[8]。因此，SAMP8小鼠是較為理想的AD動物模型[9]。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)越來越成熟，可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)間相互作用的研究，使其在尋找藥物治療靶點(diǎn)上得到廣泛應(yīng)用，但AD與杏仁核的關(guān)系及針刺干預(yù)罕見報道。為此，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，觀察補(bǔ)腎活血針刺法干預(yù)AD模型SAMP8小鼠后杏仁核蛋白組學(xué)表達(dá)的變化，尋找治療SAMP8小鼠的潛在靶點(diǎn)蛋白，為補(bǔ)腎活血針刺法治療AD奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6月齡雄性SAMP8小鼠30只，清潔級，體質(zhì)量20～25 g，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗中心，動物合格證號0004678。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只SAMP8小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為針刺組和對照組，每組15只。小鼠均飼養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，動物房內(nèi)溫度18～22 ℃，相對濕度40%～50%，保證充足的光照和通風(fēng)，自由攝食飲水。本實(shí)驗經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院實(shí)驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號LLSC（LA）2014-028]。實(shí)驗過程中操作按照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗動物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 干預(yù)

針刺組選取“百會”“血海”“腎俞”“膈俞”，“百會”向后平刺3～5 mm，“血海”“腎俞”直刺2～3 mm，“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，其中血海、腎俞、膈俞先刺激左側(cè)穴位，次日再刺激右側(cè)，交替進(jìn)行，小鼠穴位定位以及針刺深度參照《實(shí)驗針灸學(xué)》中的“動物針灸穴位圖譜”[10]。進(jìn)針后，補(bǔ)瀉手法參考針刺手法量學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[11]：“血海”“膈俞”施捻轉(zhuǎn)瀉法，施針幅度180～360°，施針頻率50～60次/min；“腎俞”“百會”施捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法，施針幅度60～90°，施針頻率120～150次/min，運(yùn)針1 min，留針10 min。對照組小鼠進(jìn)行與針刺組相同時間、相同程度捉抓刺激。各組每日做相應(yīng)處理1次，第7日暫停1次，連續(xù)干預(yù)8周。

1.3 主要試劑與儀器

蛋白提取試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技研究所），復(fù)合雙向凝膠電泳試劑（Amresco），復(fù)合質(zhì)譜鑒定試劑碳酸氫銨（Sigma）。Imagescanner掃描儀（型號ImagescannerⅡ），Image Master 2D platinum 5.0凝膠圖像分析軟件（Bio-Rad），Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀（Applied Biosystem），Mascot MS/MS數(shù)據(jù)庫查詢軟件（Matrixscience）。0.25 mm×13 mm華佗牌針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.4 杏仁核蛋白提取

針刺干預(yù)8周后，10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉小鼠，斷頸處死，將小鼠全腦完整取出，置于小鼠腦模具（深圳瑞沃德）中，參考小鼠腦立體定位圖譜定位[12]，取出杏仁核組織，用蛋白提取試劑盒分離并純化杏仁核蛋白質(zhì)，將純化的杏仁核蛋白質(zhì)離心，超聲破碎，再離心提取杏仁核蛋白質(zhì)團(tuán)塊，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雙向凝膠電泳

將2組小鼠杏仁核總蛋白質(zhì)參照Gorg A等[13]介紹的方法各進(jìn)行3次雙向凝膠電泳分離，經(jīng)銀染后得到背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的2-DE圖譜各3塊。使用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件對圖譜進(jìn)行圖像分析，將識別獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)的面積、灰度等數(shù)據(jù)擬合成一張新的凝膠，在擬合凝膠圖譜的基礎(chǔ)上對各膠進(jìn)行匹配分析。

1.6 質(zhì)譜分析與蛋白質(zhì)鑒定

將蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切割下來后，置于1.5 mL Eppendorf管中，制備好的樣品在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀上分析，在聯(lián)網(wǎng)狀態(tài)下應(yīng)用Mascot MS/MS數(shù)據(jù)庫查詢，輸入包含肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)*.DAT的文件，軟件自動鏈接http：//www.matrixscience.com網(wǎng)站，返回查詢結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 雙向凝膠電泳結(jié)果

每張膠片得到>1000個蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)絕大部分蛋白質(zhì)點(diǎn)在相同位置上豐度是一致的，通過ImageMaster 2D platinum 5.0軟件對凝膠圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，針刺組與對照組間有9個差異點(diǎn)（差異蛋白質(zhì)點(diǎn)選取標(biāo)準(zhǔn)是為蛋白質(zhì)的差異表達(dá)上升或者下降2倍以上且至少同時出現(xiàn)在3次不同的實(shí)驗中），與對照組比較，針刺組表達(dá)上調(diào)的6個，表達(dá)下調(diào)的3個。詳見圖1、圖2。

2.2 質(zhì)譜分析及蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

從針刺組中選定有待分析的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)后，采用Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜儀對差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行初步鑒定，測得各自肽質(zhì)量指紋圖譜（以1號編號蛋白為例，見圖3）。將獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)肽質(zhì)量指紋圖譜用軟件flex Analysis過濾基線峰、識別信號峰。

利用BioTools軟件搜索uniprot數(shù)據(jù)庫，通過蛋白質(zhì)點(diǎn)肽質(zhì)量指紋譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的比較來鑒定蛋白質(zhì)，得到Mascot得分（以1號編號蛋白為例，搜索到出的蛋白質(zhì)Mascot得分為171分，說明結(jié)果鑒定可靠，見圖4）。

鏈接http：//www.matrixscience.com網(wǎng)站搜索蛋白質(zhì)點(diǎn)肽質(zhì)量指紋圖譜的匹配結(jié)果見圖5。其中匹配分?jǐn)?shù)≥55的蛋白質(zhì)9個，功能涉及線粒體能量代謝、氧化應(yīng)激、Aβ產(chǎn)生等方面，包括序列裝配結(jié)構(gòu)組件50同系物（SAM50）、細(xì)胞色素b5（CYB5B）、星形膠質(zhì)蛋白（GFAP）、NAD依賴去乙?；?（SIRT2）、核不均一核糖核蛋白K（hnRNP K）、核不均一核糖核蛋白H2（hnRNP H2）、硫氧還蛋白1（TRX1）、原肌球蛋白1（TPM1）、脂筏蛋白（FLO1）。詳見表1。

3 討論

AD屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”“愚癡”等范疇。AD發(fā)病的主要中醫(yī)病理基礎(chǔ)是腎虛血瘀，并貫穿AD發(fā)病的全過程。本實(shí)驗前期研究表明，補(bǔ)腎活血針刺法能有效提高AD患者的記憶力、改善認(rèn)知功能和日常生活自理能力[14]；同時能使AD模型SAMP8小鼠水迷宮實(shí)驗逃避潛伏期縮短，改善其學(xué)習(xí)記憶能力[15-16]。補(bǔ)腎活血針刺法取腎俞、百會、血海、膈俞為基本穴位，其中腎俞為腎之背俞穴，有補(bǔ)腎助陽之功；百會處于人之頭頂，在人體的最高處，手足三陽經(jīng)及督脈的陽氣在此交會，又名三陽五會穴，三陽指手足三陽經(jīng)，五會指五臟六腑的氣血皆會于此，故刺激百會有補(bǔ)腎通腦、開竅增智、行氣活血之功；血海為血證要穴，膈俞為八會穴之血會，兩者配合，活血通脈之功尤效。以上諸穴配合，共奏補(bǔ)腎活血之功。

杏仁核位于海馬的前方和海馬旁回溝的深部，側(cè)腦室下角的前方。它與內(nèi)側(cè)顳葉、前額葉皮層、前扣帶回、丘腦和下丘腦等許多腦區(qū)有著廣泛的纖維聯(lián)系。大量研究表明，杏仁核在AD的發(fā)病過程中扮演了極為重要的角色，在早期AD患者中，杏仁核明顯萎縮且萎縮程度和疾病癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17-20]。杏仁核參與了認(rèn)知加工過程，能夠調(diào)節(jié)記憶的編碼、鞏固和提??；另外，杏仁核可能在AD的非認(rèn)知性精神行為癥狀中起著重要作用，如AD患者常出現(xiàn)的焦慮、抑郁等非認(rèn)知性癥狀與杏仁核密切相關(guān)[18]。大鼠杏仁核內(nèi)注射Aβ25-35能制備出成功的類AD模型[21]，這也反證了杏仁核在AD發(fā)病過程中的重要作用。因此，在AD的研究過程中，杏仁核是不可或缺的，具有重要的研究意義。

線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常在AD的病理過程中起著重要作用[22]。SAM50對維持線粒體形態(tài)、線粒體嵴的形態(tài)學(xué)、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物至關(guān)重要[23]。SAM50適量減少可能導(dǎo)致線粒體形態(tài)和嵴形態(tài)改變，而SAM50的嚴(yán)重消耗可能影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物，最終導(dǎo)致神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)功能紊亂[24]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血針刺法能使SAM50表達(dá)上調(diào)，推測針刺可能通過調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)來改善線粒體能量代謝障礙，實(shí)現(xiàn)對AD的治療作用。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AD的一個重要的上游致病因素。CYB5B是線粒體內(nèi)外膜之間的主要電子傳遞者，參與生物體組織中一系列重要的氧化還原反應(yīng)[25]。CYB5B活性下降會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，使電子漏增多，自由基產(chǎn)生增多，引起大量的活性氧在體內(nèi)聚集，誘發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。TRX1是體內(nèi)重要的抗氧化蛋白，能清除過量的活性氧及過氧化氫[26]，減慢超氧化物歧化酶的下降，同時能修復(fù)過氧化的巰基蛋白，減輕氧化應(yīng)激的損傷。補(bǔ)腎活血針刺法能上調(diào)CYB5B、TRX1的表達(dá)，推測其可能是通過減少自由基產(chǎn)生、抗氧化發(fā)揮作用。

Aβ作為老年斑的主要組成成分，在AD的發(fā)病中起著極為重要的作用。FLO1是β-淀粉樣蛋白前體產(chǎn)生Aβ的平臺，與Aβ在腦內(nèi)的沉積呈正相關(guān)；FLO1減少可使Aβ產(chǎn)生減少，降低Aβ的毒性作用。GFAP在激活狀態(tài)下可以產(chǎn)生Aβ[27]，而GFPA廣泛激活是AD早期的一種表現(xiàn)[28]。GFAP是神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的細(xì)胞，其產(chǎn)生的Aβ在腦內(nèi)的聚集和老年斑的形成過程中起著重要作用[29]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血針刺法下調(diào)FLO1、GFAP的表達(dá)量，提示補(bǔ)腎活血針刺法防治AD的作用可能是通過減少Aβ的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)的。

綜上，本實(shí)驗采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，通過補(bǔ)腎活血針刺法干預(yù)能調(diào)節(jié)SAMP8小鼠杏仁核內(nèi)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，其功能涉及線粒體能量代謝、氧化應(yīng)激、Aβ產(chǎn)生等方面，這些可能是補(bǔ)腎活血針刺治療AD的潛在作用靶點(diǎn)蛋白。

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（收稿日期：2017-08-09）

（修回日期：2017-09-09；編輯：華強(qiáng)）