楊姣　賀福元　劉惠　張雨恬　周逸群　肖美鳳　楊巖濤　周晉

摘要：目的 利用已建立的中藥材成分封閉體系提取動(dòng)力學(xué)模型，探討金銀花與山銀花綠原酸的提取動(dòng)力學(xué)差異。方法 采用HPLC測定金銀花與山銀花綠原酸有效含量W0及分配系數(shù)ρ2，采用吸水法測定工藝參數(shù)V1、V2再計(jì)算V0，利用SPSS19.0軟件非線性擬合得到參數(shù)M、N、L、α、β、π，用Excel2016按公式計(jì)算k、k1′、k2′、ρ1、tmax、cmax、AUC、P%、D%。運(yùn)用總量統(tǒng)計(jì)矩相似度法計(jì)算兩者的相似度。結(jié)果 金銀花的V0、V1、V2分別為18.69、9.50、30.20 mL，金銀花綠原酸W0為3.75%、ρ2為0.884；山銀花的V0、V1、V2分別為12.79、7.80、37.00 mL，山銀花綠原酸W0為5.67%、ρ2為1.020。金銀花與山銀花綠原酸藥時(shí)曲線呈三室模型，其主要提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)k分別為0.110 1、0.3755 h-1，k1′分別為3.632、3.288 h-1，k2′分別為53.12、55.28 h-1，ρ1分別為2.731、2.751，tmax分別為0.299 5、0.216 3 h，cmax分別為0.134 0、0.252 7 mg/mL，AUC分別為3.405、1.560 h，P%分別為35.73%、44.57%，D%分別為0.916 2%、2.680 7%。總量統(tǒng)計(jì)矩相似度為0.963 8，表明金銀花與山銀花綠原酸提取動(dòng)力學(xué)行為基本相似。結(jié)論 金銀花與山銀花綠原酸的溶出行為及其差異可以用中藥提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型客觀且有效地表達(dá)，本研究可以為進(jìn)一步開展金銀花與山銀花提取工藝的優(yōu)化及其制劑研究提供一定參考。

關(guān)鍵詞：金銀花；山銀花；綠原酸；提取動(dòng)力學(xué)模型；封閉體系；總量統(tǒng)計(jì)矩相似度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0091-05

Abstract： Objective To explore the extraction kinetic deviation of the chlorogenic acid （ChA） in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos through established extract kinetic model of closed system of Chinese materia medica. Methods The content of ChA （W0） and ρ2 in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos were determined by HPLC； The V1 and V2 were measured by water absorbing further to calculate V0； The value of M， N， L， α， β， and π were estimated by curve fitting using SPSS19.0 edition； The extraction kinetic parameters k， k1′， k2′， ρ1， tmax， cmax， AUC， P%， and D% were calculated by Excel； their similarity was calculate by the total quantum statistical moment similarity （TQSMS）. Results The V0， V1， and V2 for Lonicerae Japonicae Flos were 18.69， 9.50， and 30.20 mL， respectively. The W0 for the ChA in Lonicerae Japonicae Flos were 3.75%， and ρ2 was 0.884； The V0， V1， and V2 for Lonicerae Flos were 12.79， 7.80， and 37.00 mL， respectively. The W0 for the ChA in Lonicerae Flos were 5.67%， and ρ2 was 1.020； The extraction kinetic profiles for ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos were fitted three compartment model. The main kinetic parameters as k were 0.1101， 0.3755 h-1； k1′ were 3.632， 3.288 h-1； k2′ were 53.12， 55.28 h-1； ρ1 were 2.731， 2.751； tmax were 0.299 5， 0.216 3 h； cmax were 0.134 0， 0.252 7 mg/mL； AUC were 3.405， 1.560 h； P% were 35.73% and 44.57%； D% were 0.916 2% and 2.680 7%， respectively. Their TQSMS was 0.963 8， which indicated that the extraction kinetics of ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos had good similarity. Conclusion The extraction kinetic model described the dissolution behavior and deviation of extraction kinetic profiles for ChA in Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos objectively and effectively. This research can provide some references for further study on extraction processes and preparation of Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos.

Keywords： Lonicerae Japonicae Flos； Lonicerae Flos； chlorogenic acid； extraction kinetic model； closed system； total quantum statistical moment similarity

中藥材由于生物體組織構(gòu)成及成分的復(fù)雜性和多樣性，影響其提取因素眾多，但其綜合效果可用提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型及參數(shù)表達(dá)。中藥成分從藥材組織中溶出經(jīng)歷3個(gè)階段[1-2]：首先，溶劑向藥材內(nèi)部滲透和藥材的潤濕，即浸潤解吸；其次，依靠溶質(zhì)的溶劑化等將溶質(zhì)溶解到固液界面上，即置換溶解；最后，溶質(zhì)從藥材內(nèi)部向藥材表面以及由藥材表面向溶液主體的擴(kuò)散，即傳質(zhì)擴(kuò)散。根據(jù)提取方式可分為封閉體系（成分在提取過程中不被溶媒帶出提取體系，如浸漬法、回流法、煎煮法等）和開放體系（成分在提取過程中被溶媒帶出提取體系，如水蒸氣蒸餾法、滲漉法、索氏提取法等）。據(jù)此，前期研究建立了一系列適合中藥材成分提取動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型[3]，該模型充分地考慮到了中藥材吸水膨脹、存在藥材內(nèi)透細(xì)胞膜傳質(zhì)擴(kuò)散、中藥成分消除分解的實(shí)際情況，并進(jìn)行了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)[2，4]。

金銀花與山銀花藥用歷史悠久，始載于南朝陶弘景的《名醫(yī)別錄》。依據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》[5]，金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花；山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.和黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花。兩者原同屬金銀花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱功效，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等病癥。綠原酸作為金銀花和山銀花藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分之一，藥理研究表明其具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降脂、降糖等作用[6-9]。本研究針對金銀花與山銀花的“異質(zhì)等效”現(xiàn)象[10]，以金銀花和山銀花綠原酸為模型成分，采用回流提取方式，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已建立的中藥材成分封閉體系提取動(dòng)力學(xué)模型，測定金銀花與山銀花綠原酸提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并對參數(shù)進(jìn)行分析，以此探討二者的綠原酸提取動(dòng)力學(xué)差異，旨在揭示金銀花與山銀花在異質(zhì)成分環(huán)境中綠原酸的提取動(dòng)力學(xué)行為，為進(jìn)一步論證金銀花與山銀花的“異質(zhì)等效”現(xiàn)象提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 封閉體系中藥提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型及參數(shù)求解

1.1 封閉體系的數(shù)學(xué)模型

運(yùn)用FICK定律、固體制劑Noyes-whitney溶出理論及動(dòng)力學(xué)理論可建立微積分方程組，此方程組為封閉系，是中藥提取的基礎(chǔ)方程組[2-3]。

上述諸式中，α、β、π為混雜參數(shù)，其中α為快置擴(kuò)散速度常數(shù)，β為慢置消除速度常數(shù)，π為慢置擴(kuò)散速度常數(shù)，α、β、π分別代表3個(gè)指數(shù)項(xiàng)即2個(gè)兩室間擴(kuò)散和1個(gè)消除的特征，由強(qiáng)度性工藝參數(shù)k、k1′、k2′、ρ1、ρ2、A1、A2及容量性工藝參數(shù)V0、V1、V2決定，而與有效成分含量W0無關(guān)。M、N、L、α、β、π由k1′、k2′、A1、A2、C00（W0/V0）決定。

1.2 參數(shù)的測定及計(jì)算

1.2.1 需測定參數(shù)

包括有效成分含量W0、藥材細(xì)胞室溶液體積V0、質(zhì)外體室溶液體積V1、溶液室溶液體積V2、分配系數(shù)（平衡時(shí)質(zhì)外體室與溶液室成分濃度之比）ρ2，以及采集不同時(shí)間t樣品液含量C2t。

1.2.2 需計(jì)算的參數(shù)

首先用SPSS19.0軟件的曲線迭代法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化估算求得M、N、L、α、β、π，再根據(jù)公式計(jì)算參數(shù)k、k1′、k2′、ρ1、tmax、cmax、AUC、P%、D%。

2 儀器與試藥

Waters 1525 Binary HPLC Pump，Breeze色譜工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，Waters 2410 Refractive Index Detector，H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），EKUP-II-20T型超純水系統(tǒng)（長沙市科臨電子科技有限公司）

金銀花（委托本校第一附屬醫(yī)院藥劑科定點(diǎn)采購）、山銀花（購于湖南隆回），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥炮制教研室石繼連副教授鑒定，分別為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.及灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開的花。綠原酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，HPLC純度≥98%，批號R05F6F1），乙腈（色譜純，美國Tedia公司，Lot 17065164），磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20170313）。

3 方法

3.1 色譜條件

Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.4%磷酸溶液-乙腈（87∶13），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為327 nm，柱溫為30 ℃。

3.2 供試品溶液制備

3.2.1 對照品溶液配制

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，用甲醇配制成0.078 mg/mL的綠原酸對照品溶液。

3.2.2 有效成分含量W0的測定

分別取金銀花和山銀花，粉碎并過4號篩，取1 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶內(nèi)，加入100 mL甲醇，加熱回流提取1 h，過濾，所得濾液4 ℃保存，待進(jìn)樣測定。

3.3 藥材細(xì)胞室溶液體積V0、質(zhì)外體室溶液體積V1、溶液室溶液體積V2的測定

分別取金銀花和山銀花各5 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶內(nèi)，稱重得W1，加入近沸騰的純水100 mL，稱重得W2，加熱回流提取2 h，傾出水液至瀝盡，所得水液體積為V2，其吸水膨脹的藥材采用離心法[11]測定，得到V1，再根據(jù)公式V0+V1=（W2-W1）÷d-V2得到V0。

3.4 分配系數(shù)ρ2的測定及ρ1的計(jì)算

取上述金銀花與山銀花溶液室及質(zhì)外體室藥液，測定綠原酸含量，即得溶液室和質(zhì)外體室藥液中綠原酸含量，分別為C2、C1。按公式ρ2=C1/C2計(jì)算得到ρ2，再按公式（2）計(jì)算得到ρ1。

3.5 不同時(shí)間樣品液的采集及含量測定

分別取金銀花與山銀花各10 g，精密稱定，置于三口圓底燒瓶中，加入近沸騰純水220 mL，兩口用塞子密閉，另一口接冷凝管，整個(gè)裝置置于可調(diào)電壓（0～300 V）的電熱套內(nèi)，馬上打開電熱套加熱至滴下第一滴回流液時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別于5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min定時(shí)取得各時(shí)間點(diǎn)2 mL樣品液，并補(bǔ)充等量純水。樣品液4 ℃保存，待進(jìn)樣測定。

3.6 方法學(xué)考察

3.6.1 線性范圍考察

精密吸取綠原酸對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL置于量瓶中，加入甲醇至5 mL，得0.007 8、0.015 6、0.023 4、0.031 2、0.039 0 mg/mL各濃度溶液。按上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到回歸方程Y=4.68×10-7X-208 397（r=0.999 4），線性范圍為1.56×10-4～7.80×10-4 g。

3.6.2 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取金銀花和山銀花溶液室溶液各20 μL，按上述色譜條件測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定綠原酸峰面積，得到金銀花與山銀花中綠原酸峰面積的RSD分別為4.88%、4.51%，表明儀器精密度良好。

3.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取同一批金銀花、山銀花，按“3.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL測定，計(jì)算得到RSD分別為1.82%、2.11%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

室溫條件下，分別取金銀花和山銀花的5 min時(shí)樣品液作為供試品溶液，分別于0、8、12、24、48 h時(shí)按上述色譜條件進(jìn)樣20 μL測定，計(jì)算其RSD，分別為2.81%，3.50%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6.5 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密吸取金銀花和山銀花溶液室溶液100 μL各6份，再精密加入一定量的對照品溶液，混勻，按上述色譜條件進(jìn)行測定并計(jì)算回收率，得到金銀花與山銀花中綠原酸的平均回收率分別為99.43%，98.56%，RSD分別為4.18%、3.79%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)果

4.1 金銀花與山銀花綠原酸提取工藝參數(shù)測定結(jié)果

按“3.2”“3.3”“3.4”項(xiàng)下操作，取樣品液，過0.45 μm微孔濾膜，按上述色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算。得到金銀花綠原酸W0=3.75%，ρ2=0.884，V0=18.69 mL，V1=9.50mL，V2=30.20 mL；山銀花綠原酸W0=5.67%，ρ2=1.02，V0=12.79mL，V1=7.80 mL，V2=37.00 mL。

4.2 不同時(shí)間金銀花與山銀花綠原酸含量測定

按“3.5”項(xiàng)下方法，取樣品液過0.45 μm微孔濾膜，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，得到不同時(shí)間金銀花與山銀花綠原酸HPLC色譜圖見圖1、圖2，提取動(dòng)力學(xué)藥時(shí)曲線見圖3。

4.3 曲線擬合及參數(shù)計(jì)算

根據(jù)金銀花與山銀花中綠原酸提取動(dòng)力學(xué)的藥時(shí)數(shù)據(jù)，先用殘差法再采用SPSS19.0多元曲線非線性參數(shù)估計(jì)可得回歸方程M、N、L、α、β、π值，結(jié)果見表1；按文獻(xiàn)[2-3]中提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)公式與步驟，采用Excel2016軟件計(jì)算各工藝參數(shù)k、k1′、k2′、ρ1、AUC、tmax、cmax、P%、D%，結(jié)果見表2。最后進(jìn)行總量統(tǒng)計(jì)矩相似度計(jì)算[12-14]。

5 討論

本研究在前期建立的中藥材成分封閉體系提取動(dòng)力學(xué)模型基礎(chǔ)上展開金銀花與山銀花中綠原酸在回流提取過程中動(dòng)力學(xué)的差異研究。首先，從表1來看，金銀花與山銀花綠原酸提取動(dòng)力學(xué)符合三室模型（P<0.01）。其次，從金銀花與山銀花綠原酸提取動(dòng)力學(xué)藥時(shí)曲線來看，山銀花綠原酸含量均高于金銀花綠原酸含量，且均符合2015年版《中華人民共和國藥典》中金銀花綠原酸含量不得少于1.5%、山銀花綠原酸含量不得少于2.0%的規(guī)定。再者，金銀花與山銀花綠原酸的ρ1、ρ2均不為1，表明各室的表觀濃度各不相等；其中ρ2為實(shí)驗(yàn)所測，提取過程中有效成分溶出愈多，其值愈小，本實(shí)驗(yàn)中金銀花綠原酸ρ2（0.884）<山銀花綠原酸ρ2（1.020），由此可推知，金銀花綠原酸成分溶出高于山銀花綠原酸。從P%、D%來看，山銀花綠原酸的提取率（44.57%）明顯高于金銀花綠原酸（35.73%），但金銀花綠原酸的損失率（0.916 2%）卻低于山銀花綠原酸（2.680 7%），這可能是由于綠原酸隨著加熱時(shí)間增長而有所分解[15]，山銀花綠原酸分解較金銀花綠原酸分解程度高，導(dǎo)致濃度變化較大，故損失也較大。直觀可以看出，金銀花與山銀花綠原酸的提取動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在一定差異，但通過對金銀花與山銀花綠原酸進(jìn)行總量統(tǒng)計(jì)矩相似度[12-13]計(jì)算，兩者的相似度為0.963 8，大于總量統(tǒng)計(jì)矩相似度界值0.874 9[14]，表明兩者的提取動(dòng)力學(xué)行為基本相似。

綜上所述，金銀花與山銀花綠原酸的溶出行為及其差異可以用中藥提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型客觀且有效地表達(dá)。進(jìn)行金銀花與山銀花的提取動(dòng)力學(xué)研究可以為后期進(jìn)一步開展金銀花與山銀花提取工藝的優(yōu)化及其制劑研究提供一定參考。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究尚存在一些不足之處，如藥材批次較少，模型成分只選擇了一種有效成分，鑒于此，后期會(huì)增加藥材批次，并結(jié)合質(zhì)譜等篩選出更多合適的標(biāo)志物，更全面、深入地開展金銀花與山銀花的提取動(dòng)力學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 儲茂泉，劉國杰.中藥提取過程的動(dòng)力學(xué)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（7）：559-562.

[2] 賀福元，鄧凱文，羅杰英，等.中藥復(fù)方成分提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型的初步研究[J].中國中藥雜志，2007，32（6）：490-495.

[3] 賀福元，鄧凱文，楊大堅(jiān)，等.中藥材成分提取動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型的建立及參數(shù)分析[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2005，18（6）：513-517.

[4] 賀福元，鄧凱文，吳德智，等.左金方與黃連中小檗堿型生物堿提取動(dòng)力學(xué)差異性的研究[J].中成藥，2009，31（9）：1354-1359.

[5] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：30-31，221.

[6] 林學(xué)政，柳春燕，陳靠山，等.不同地域牛蒡葉綠原酸的含量比較及其抑菌實(shí)驗(yàn)[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16（4）：328-330.

[7] 胡克杰，孫考祥，王璟璐，等.氯原酸體外抗病毒作用研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，35（6）：430-432.

[8] 張鞍靈，馬瓊，高錦明，等.綠原酸及其類似物與生物活性[J].中草藥， 2001，32（2）：173-176.

[9] 王強(qiáng)，陳東輝，鄧文龍.金銀花提取物對血脂與血糖的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（3）：40-42.

[10] 賀福元，賀紅，鄧凱文，等.借超分子“印跡模板”的自主作用解開金（山）銀花紛爭[J].中國中藥雜志，2016，41（6）：1152-1160.

[11] 王震宇，陶洪斌，唐玉林.植物質(zhì)外體的研究方法[J].植物生理學(xué)通訊，1999，35（5）：394.

[12] 賀福元，羅杰英，鄧凱文.中藥復(fù)方動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型-總量統(tǒng)計(jì)矩法的研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2006，8（6）：13-18.

[13] 黃勝，賀福元，劉文龍，等.總量統(tǒng)計(jì)矩相似度法對左金緩釋片多成分釋放相似度的評價(jià)研究[J].中成藥，2009，31（1）：35-39.

[14] 賀福元，鄧凱文，黃勝，等.總量統(tǒng)計(jì)矩標(biāo)準(zhǔn)相似度數(shù)學(xué)模型的建立及應(yīng)用研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48（9）：1453-1458.

[15] 張丹，李章萬，姜焱.HPLC測定金銀花、菌陳及其10種中成藥中綠原酸的含量[J].藥物分析雜志，1996，16（2）：83-85.

（收稿日期：2017-11-23）

（修回日期：2017-12-21；編輯：陳靜）