孔曉妮　許一平　沈偉　周洪雷

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）02-0172-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.07

摘 要 目的：建立翻白草藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行真?zhèn)舞b別。方法：采用HPLC法，色譜柱為InertSustain C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。以蘆丁為參照，繪制19批翻白草藥材樣品和2批委陵菜藥材樣品的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004）對21批藥材樣品進(jìn)行相似度評價，確定19批翻白草藥材樣品的共有峰，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。結(jié)果：19批翻白草藥材樣品的HPLC圖譜有18個共有峰， 相似度均大于0.9，其HPLC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性；而2批委陵菜藥材樣品相似度均小于0.7。21批藥材樣品可聚為2大類，即2批委陵菜藥材樣品為一類，19批翻白草藥材樣品為一類，而翻白草藥材樣品可聚為4類；19批翻白草藥材樣品中蘆丁、槲皮苷為主成分。結(jié)論：所建指紋圖譜可為翻白草藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價提供參考。

關(guān)鍵詞 翻白草；高效液相色譜法；指紋圖譜；真?zhèn)舞b別

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprints of Potentilla discolor， and to conduct authenticity identification. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on InertSustain C18 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min， detection wavelength of 360 nm， column temperature of 30 ℃， sample size of 10 μL. Using rutin as reference， HPLC chromatograms of 19 batches of P. discolor and 2 batches of P. chinesis were determined. TCM Fingerprint Similarity Evaluation System （2004） was used for similarity evaluation of 21 batches of samples， and common peak identification of 19 batches of P. discolor. SPSS 21.0 statisticl software was used for main component analysis and cluster analysis. RESULTS： There were 18 common peaks in HPLC fingerprints of 19 batches of P. discolor， the similarity was higher than 0.9. HPLC chromatogram was in good agreement with control fingerprint. The similarity of 2 batches of P. chinesis was lower than 0.7. The 21 batches of medicinal materials could be grouped into 2 categories， 2 batches of P. chinesis could be grouped into a category， 19 batches of P. discolor could be grouped into a category. P. discolor could be grouped into 4 categories. Rutin and quercitrin were main ingredients in 19 batches of P. discolor. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide reference for authenticity identification and quality evaluation of P. discolor.

KEYWORDS Potentilla discolor； HPLC； Fingerprint；Authenticity identification

翻白草（Potentilla discolor Bge）為薔薇科委陵菜屬植物，又名雞腳草、雞腿根、雞腿兒、葉下白、天青地白、白背葉等，是一種多年生草本植物[1]。翻白草性平，味甘、微苦，歷代本草記載其具有止血止痢、清熱解毒、消腫之功效；民間有利用翻白草代茶飲治療糖尿病的記載，現(xiàn)代研究也表明其具有治療2型糖尿病的作用[2-3]。委陵菜由于形似翻白草，常為人們混用。目前，已從翻白草藥材中分離得到多種黃酮類、多酚類、萜類和甾體類成分[4-7]。但2015年版《中國藥典》（一部）僅以薄層色譜鑒別、浸出物含量測定對其進(jìn)行質(zhì)量控制，無法全面地反映該藥材品質(zhì)。本課題組對21批翻白草和委陵菜藥材進(jìn)行研究，建立了翻白草藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并對其與委陵菜進(jìn)行了真?zhèn)舞b別，可為全面控制和評價翻白草藥材的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030系列HPLC儀，包括二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）； BSA224S-CW型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SK7200HP型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（南通滬南科學(xué)儀器有限公司）；FZ102型微型植物粉碎機 （上海巖征生物科技有限公司）。

1.2 試劑

蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：91.9%）、槲皮苷對照品（批號：111538-201105，純度：92.7%）、槲皮素對照品（批號：100081-201509，純度：98.1%）、山柰酚對照品（批號：110861-201611，純度：95.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

19批翻白草藥材和2批委陵菜藥材來源于全國9個省份（見表1），經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校王興順副教授鑒定為各自的真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，12%B→20%B；20～25 min，20%B；25～35 min，20%B→40%B；35～40 min，40%B→70%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚質(zhì)量濃度分別為1.381、0.820、0.915、0.965 mg/mL的單一對照品貯備液。取上述單一對照品貯備液各適量，置于同一量瓶中，加甲醇稀釋，制成蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚質(zhì)量濃度分別為13.810、8.200、1.830、0.386 μg/mL的混和對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品約0.25 g，粉碎（過20目篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加90%甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，30 ℃下超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用90%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S18）適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以蘆丁的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD<3.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S18）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以蘆丁的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD<3.0%（n=6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材樣品（編號：S18）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以蘆丁的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，18個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD<3.0%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取19批翻白草藥材樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）對19批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A），以翻白草藥材樣品HPLC對照指紋圖譜為參照，進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示，19批翻白草藥材樣品相似度均大于0.9，說明各批翻白草藥材樣品具有較高的均一性，詳見表2。在相同色譜條件下，采集2批委陵菜藥材樣品HPLC圖譜，將翻白草藥材樣品HPLC對照指紋圖譜和2批委陵菜藥材樣品HPLC圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 B），計算得到2批委陵菜藥材樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.688、0.698，表明采用HPLC指紋圖譜可以從化學(xué)成分上較好地區(qū)別翻白草與委陵菜藥材，詳見表2。

2.4.3 共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，通過比較色譜圖，對圖2中主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)[8-9]。結(jié)果，得18個共有峰，其中8號峰為蘆丁，11號峰為槲皮苷，15號峰為槲皮素，17號峰為山柰酚。8號峰（蘆丁）分離良好、峰面積較大，在圖譜中較穩(wěn)定，因此確定其為參照峰（S）。計算其他峰相對于8號峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表3、表4。

2.5 聚類分析與主成分分析

2.5.1 聚類分析 以各共有峰相對峰面積為變量，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對21批藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式，詳見圖3。由圖3可見，21批藥材樣品可聚為2大類：翻白草藥材和委陵菜藥材；翻白草藥材樣品可聚為4類： S9、S10、S12、S3、S4、S7、S14、S15、S16、S2、S1、S11、S18為Ⅰ類，S6、S13為Ⅱ類，S8、S17、S5為Ⅲ類，S19為Ⅳ類，其中Ⅳ類S19樣品（廣西）與其余批樣品的距離較大，即在質(zhì)量上存在較大差別。

2.5.2 主成分分析 以各共有峰相對峰面積為變量，利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并進(jìn)行主成分分析。根據(jù)主成分特征值和貢獻(xiàn)率，提取了4個主成分因子（A1～A4），其累積貢獻(xiàn)率達(dá)78.07%。其中，A1特征值為5.82，貢獻(xiàn)率為32.33%；A2特征值為3.34，貢獻(xiàn)率為18.57%；A3特征值為3.02，貢獻(xiàn)率為16.75%；A4特征值為1.88，貢獻(xiàn)率為10.42%。旋轉(zhuǎn)后的主成分因子載荷矩陣見表5，其中載荷量表示主成分與對應(yīng)變量（共有峰）的相關(guān)系數(shù)，反映各指標(biāo)對主成分貢獻(xiàn)的大小，因子載荷量符號表示各指標(biāo)對改變主成分值增減的效果。由表5可見，8、4、11號峰在A1中有明顯正相載荷，前3名變量的權(quán)重值分別為0.934、0.908、0.877（即8、4、11號峰），表明這3個峰在區(qū)分翻白草和委陵菜藥材及不同批翻白草藥材中起重要作用。

3 討論

本課題組共收集19批翻白草藥材樣品，建立了翻白草藥材HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了18個共有峰，并指認(rèn)了4個峰，分別為蘆丁、槲皮苷、槲皮素、山柰酚。相似度分析中，所得19批翻白草藥材樣品的HPLC圖譜基本吻合，相似度均大于0.9，與委陵菜藥材樣品可明顯區(qū)別。主成分分析中，貢獻(xiàn)率最大的3個成分為峰8（蘆?。?、峰4（待定）和峰11（槲皮苷），其中8、11號峰屬于黃酮類化合物。文獻(xiàn)報道翻白草總黃酮具有良好的降血糖、抗氧化、抗炎作用[10-12]，因此蘆丁、槲皮苷可作為翻白草藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。在翻白草和委陵菜藥材鑒別方面，本課題組建立的翻白草藥材HPLC指紋圖譜可有效區(qū)分上述兩種藥材。

綜上所述，所建指紋圖譜可為翻白草藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評價提供參考。

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（收稿日期：2017-05-12 修回日期：2017-06-09）

（編輯：張 靜）