耿　青，肖　煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，楊　弘

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214081；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214081)

尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)原產(chǎn)于非洲，已成為我國(guó)主要養(yǎng)殖的淡水魚(yú)類之一。養(yǎng)殖過(guò)程中尼羅羅非魚(yú)的雄魚(yú)生長(zhǎng)速率顯著高于雌魚(yú)，引起研究學(xué)者對(duì)羅非魚(yú)的性別調(diào)控的廣泛興趣。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚(yú)的有絲分裂中期分裂相中存在一對(duì)中部著絲粒染色體，顯著大于其他染色體對(duì)，并命名為1號(hào)染色體，推測(cè)1號(hào)染色體可能存在性別決定基因[1-3]。1998年Kocher等[4]構(gòu)建了尼羅羅非魚(yú)第一代遺傳連鎖圖譜，后續(xù)研究表明，圖譜上的部分分子標(biāo)記與羅非魚(yú)的性別連鎖相關(guān)[5]。

目前，染色體的分離手段主要分為兩種：玻璃針?lè)蛛x法和激光切割法。上世紀(jì)80年代，研究者首次運(yùn)用顯微玻璃針?lè)蛛x法來(lái)獲得果蠅唾腺染色體特異區(qū)域，并成功克隆報(bào)道[6]。這項(xiàng)技術(shù)打開(kāi)染色體分離技術(shù)在動(dòng)植物遺傳學(xué)應(yīng)用研究的大門。同時(shí)，顯微玻璃針?lè)蛛x技術(shù)對(duì)操作人員的實(shí)驗(yàn)操作要求較高，一定程度上限制該技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。近年來(lái)，激光微束切割儀的出現(xiàn)，研究者創(chuàng)造出利用激光微束，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制軌跡，切割目標(biāo)染色體的方法[7-8]。將該方法與PCR技術(shù)結(jié)合，推動(dòng)單染色體擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建的快速發(fā)展。目前，該技術(shù)相繼在人[9]、小麥[10]、大麥[11]、棉花[12]、楊樹(shù)[13]、山羊[14]等多種動(dòng)植物的染色體顯微分離和文庫(kù)構(gòu)建的研究中得到應(yīng)用，但其在魚(yú)類研究中的相關(guān)報(bào)道很少。本研究利用激光顯微切割法收集尼羅羅非魚(yú)的1號(hào)染色體，通過(guò)特異性酶切、LA-PCR體外擴(kuò)增、電泳回收、連接轉(zhuǎn)化、感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)等步驟優(yōu)化建立尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體微克隆文庫(kù)的方法。為從尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體上篩選特異性性別相關(guān)標(biāo)記，開(kāi)展分子輔助育種提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1　材料

LMD 6000顯微操作系統(tǒng)為 Leica 公司產(chǎn)品，PHA、秋水仙素購(gòu)自Sigma公司。蛋白酶 K、Sau3AI、T4連接酶等試劑均由TaKaRa公司提供。100 g左右的XY型尼羅羅非魚(yú)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地提供。

1.2　方法

1.2.1染色體標(biāo)本的制備

參考人的植物血細(xì)胞凝集素(PHA)體內(nèi)注射法[15]，按魚(yú)體重以10 μg/g的量向一條XY型尼羅羅非魚(yú)的胸鰭基部注射PHA(PHA為凍干粉制劑，以1 mg/mL的濃度溶解于滅菌的0.8% NaCl溶液中)28～30 h后，按魚(yú)的體重以2 μg/g 的劑量注射秋水仙素溶液(秋水仙素為凍干粉制劑，以0.2 mg/mL的濃度溶解于滅菌的0.8% NaCl溶液中)，1.5～2 h后將實(shí)驗(yàn)魚(yú)解剖取出頭腎組織，置于盛有0.8% NaCl的培養(yǎng)皿中，清洗2次。在100目的過(guò)濾篩網(wǎng)上研磨頭腎組織，加入8 mL生理鹽水過(guò)濾沖洗后移入15 mL的離心管中，用吸管反復(fù)吹打至細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液以1 000g的轉(zhuǎn)速離心 5 min，棄上清，收集底部沉淀。低滲處理：加入經(jīng)37 ℃ 預(yù)溫的0.75 mol/L KCl溶液低滲處理30 min，使細(xì)胞膨脹。再次將細(xì)胞懸液以1 000g的轉(zhuǎn)速離心 5 min，棄上清，收集底部沉淀。預(yù)固定、一次固定和二次固定，按照普通核型制備條件進(jìn)行[16]。制片:將預(yù)冷的POL膜載片放置成45 ℃角，從1 m高處滴片，每片滴加懸液2～3滴，再將膜載片放入70 ℃烘箱中放置30 s，干燥后用10%姬姆薩染色液染色30 min，然后用蒸餾水輕輕沖洗膜片，室溫晾干后于-20 ℃保存。

1.2.2目標(biāo)染色體的顯微分離與收集

在LMD 6000激光顯微鏡的40倍物鏡下，找到60個(gè)分散良好的分裂相，依次做好定位標(biāo)記。將物鏡調(diào)150倍油鏡后，通過(guò)定位尋找到1號(hào)染色體，激光照射消除周圍染色體和雜質(zhì)，從中選出10對(duì)完整的1號(hào)染色體切下，保留于20 μL反應(yīng)緩沖液(5 g/L蛋白酶K，1 ×T4 DNA連接酶緩沖液配制)的0.2 mL PCR管中。12 000g離心30 s，-20 ℃存放待用。

1.2.3蛋白酶K的消化與Sau3AI接頭的制備

將含1號(hào)染色體的0.2 mL PCR管置于37 ℃下溫育2 h，使蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75 ℃下20 min滅活蛋白酶K。參考Chen等[17]的接頭的制備方法，將100 μmol/L的19mer和23mer各1 μL加入到含58 μL dH2O的PCR管中，在PCR儀中90 ℃變性 2 min，55 ℃退火20 min，冷卻后加dH2O 140 μL，濃度為50 ng/μL.取10 μL加入90 μL 20 mmol/L ATP(1 ×T4 DNA連接緩沖液配制)至100 μL，制成接頭工作液。引物23mer和19mer由上海基康生物技術(shù)公司合成，序列分別為23mer:5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3；19mer:5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′。

1.2.41號(hào)染色體的體外擴(kuò)增

在去蛋白的染色體DNA中加入2 μLSau3AI(0.01 U/μL，1×T4 DNA連接酶緩沖液配制)，37 ℃酶切2 h，于70 ℃下20 min滅活Sau3AI酶。加入2 μL上述制備好的Sau3AI接頭(50 ng/μL)、1.5 U T4 DNA連接酶(3 U/μL)，16 ℃連接過(guò)夜(連接反應(yīng)終體積為24.5 μL)，最后于70 ℃下20 min滅活連接酶。經(jīng)上述酶切、連接后的單染色體即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的總體積為60 μL，6 μL 10×Taq酶緩沖液、4 μL MgCl2(25 mmol/L)、8 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL 19堿基引物(20 μmol/L)、0.5 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)至60 μL。用ABI Veriti 96 Well 型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min，35個(gè)循環(huán)94 ℃ 1 min→50 ℃ 1 min→ 72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸15 min。第1輪PCR擴(kuò)增在酶切、連接單染色體DNA的同一PCR管中進(jìn)行。第2輪PCR擴(kuò)增從第1輪PCR產(chǎn)物中取2 μL作為模板，其他反應(yīng)成分不變，PCR反應(yīng)程序與上述方法相同，將35個(gè)循環(huán)降至20個(gè)循環(huán)。此步驟設(shè)基因組DNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照和嚴(yán)格不含染色體DNA的陰性對(duì)照。

1.2.5尼羅羅非魚(yú)基因組DNA的提取和純化

取1 μg基因組 DNA用Sau3AI酶 37 ℃酶切過(guò)夜，與陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和單染色體LA-PCR第2輪的擴(kuò)增產(chǎn)物一起在1.0%瓊脂糖凝膠低電壓電泳直到完全跑開(kāi)。進(jìn)行 Southern 印跡轉(zhuǎn)膜，以及地高辛(Digoxin)標(biāo)記系統(tǒng)的非同位素雜交。用經(jīng)EcoRI酶切、DIG 標(biāo)記的尼羅羅非魚(yú)基因組 DNA 作為探針進(jìn)行 Southern blot。具體操作步驟參照羅氏地高辛標(biāo)記DNA和檢測(cè)試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)說(shuō)明書(shū)。

1.2.6微衛(wèi)星檢測(cè)

以1號(hào)染色體擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，使用已在尼羅羅非魚(yú)基因組上定位的兩對(duì)微衛(wèi)星引物UNH971和UNH106進(jìn)行 PCR 檢測(cè)(表1)。PCR 反應(yīng)體系含1 μL模板、0.4 μL(10 mmol/L) dNTP、1 U Taq 酶、1.5 μL(5 mmol/L)引物、2 μL 10×Buffer，用無(wú)菌水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性 5 min、95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃ 延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)：72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)完畢后，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1　兩對(duì)微衛(wèi)星引物特征Tab.1　Two pairs of microsatellite primers’ characteristics

1.2.7單染色體微克隆文庫(kù)的構(gòu)建

第二輪 LA-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用天根DNA膠回收純化試劑盒回收純化，取1 μL與pGEM-T Easy Vector(Promega)載體連接，采用熱擊轉(zhuǎn)化法將重組片段導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞JM109中，并將轉(zhuǎn)化菌涂于含有氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的LB平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算 6個(gè)板的陽(yáng)性克隆數(shù)。在超凈工作臺(tái)上挑取白斑菌于LB培養(yǎng)基中并加入15%甘油于-80 ℃下長(zhǎng)期保存。從文庫(kù)中隨機(jī)選取部分重組克隆子并采用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。以19堿基引物對(duì)部分重組克隆子進(jìn)行擴(kuò)增，其中20 μL擴(kuò)增體系：2.0 μL 10×Taq Buffer(含Mg2+)、4 μL dNTPs(2.5 mmol/L )、1 μL 19堿基引物(10 μ)、0.5 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL )、質(zhì)粒0.5 μL和 ddH2O 1 μL；PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃ 變性 1 min，58 ℃復(fù)性 45 s，72 ℃延伸 2.5 min，共 30 個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸 8 min。擴(kuò)增結(jié)束后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1　染色體的識(shí)別與標(biāo)本制備

對(duì)尼羅羅非魚(yú)60個(gè)分散清晰的細(xì)胞中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，如表2，其染色體數(shù)目主要是在39～44之間，其中80%的染色體數(shù)目為44。因此尼羅羅非魚(yú)染色體數(shù)是2n=44。

表2　從60個(gè)細(xì)胞計(jì)算出的尼羅羅非魚(yú)前中期染色體的數(shù)目Tab.2　Distribution of chromosome numbers in 60 metaphases cells from O.niloticus

2.2　染色體的顯微切割

在切割過(guò)程中，激光器的能量越高，越易造成切割部位染色體的灼傷，激光器的能量過(guò)低，切割越困難。因此切割時(shí)需要依據(jù)不同部位調(diào)整能量，以確?？梢郧懈钕聛?lái)又不會(huì)造成染色體灼傷。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，采用萊卡公司LMD 6000激光顯微切割系統(tǒng)，當(dāng)激光輸出值為20～40，速度為2～4，能取得較好的切割效果，樣品損傷光斑直徑可小于1 μ。圖1為激光顯微切割前后的染色體對(duì)比圖，從圖中可以看到分離了完整的一對(duì)1號(hào)染色體。

圖1　尼羅羅非魚(yú)中期染色體及1號(hào)染色體的分離Fig.1　The metaphase chromosome and chromosome 1 separation in O.niloticus

2.3　1號(hào)染色體的體外擴(kuò)增

圖2為第2輪擴(kuò)增的結(jié)果， 二次分離的1號(hào)染色體擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小均為250～2 000 bp，尼羅羅非魚(yú)基因組DNA為擴(kuò)增模板的陽(yáng)性對(duì)照所得產(chǎn)物片段，較1號(hào)染色體擴(kuò)增產(chǎn)物的范圍寬，陰性對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，說(shuō)明沒(méi)有外源DNA的污染。

圖2　LA-PCR第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Image of agarose gel electrophoresis of the LA-PCR 2nd round amplification’s products

2.4　Southern blot驗(yàn)證

用經(jīng)Sau3AI酶切、DIG 標(biāo)記的尼羅羅非魚(yú)基因組 DNA 作為探針對(duì) LA-PCR 第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot 驗(yàn)證，結(jié)果如圖3。陽(yáng)性對(duì)照、Sau3AI酶切的基因組DNA和單染色體擴(kuò)增產(chǎn)物都有明顯的雜交信號(hào)，而陰性對(duì)照則沒(méi)有出現(xiàn)。結(jié)果表明，單染色體的擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)來(lái)自尼羅羅非魚(yú)的基因組。

圖3　Southern blot驗(yàn)證Fig.3　Verification with Southern blot

2.5　SSR檢測(cè)

已定位在尼羅羅非魚(yú)基因組上的 SSR 引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 PCR 分析，結(jié)果顯示引物對(duì)UNH971，UNH106從1號(hào)染色體的擴(kuò)增產(chǎn)物中能夠擴(kuò)增出目的條帶(圖4)。這表明單染色體擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)是來(lái)自尼羅羅非魚(yú)基因組，本試驗(yàn)對(duì)尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體的分離和擴(kuò)增是成功的。

圖4　SSR引物對(duì)單染色體擴(kuò)增產(chǎn)物的 PCR分析結(jié)果Fig.4　Results of PCR analysis on single chromosomes 1 amplification products of SSR primers

2.6　尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體質(zhì)粒文庫(kù)的構(gòu)建立

尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體第 2 輪LA-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與 pGEM-Easy Vector連接，采用熱擊轉(zhuǎn)化法將重組片段導(dǎo)入JM109感受態(tài)細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化菌涂于含有Amp、IPTG和 X-gal 的6個(gè)LB平板上37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，均長(zhǎng)出密度適中的白色菌落，平均每板約有146個(gè)陽(yáng)性克隆。19mer引物擴(kuò)增部分重組質(zhì)粒，1.0%凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖5顯示，克隆片段長(zhǎng)度分布在300～600 bp，平均為400 bp左右。

圖5　部分重組質(zhì)粒經(jīng)19mer引物擴(kuò)增后電泳結(jié)果Fig.5　Electrophoresis results of some recombinant plasmid with 19mer primer

3　討論

3.1　尼羅羅非魚(yú)染色體標(biāo)本制備過(guò)程中的操作優(yōu)化

魚(yú)類染色體的研究已有半個(gè)多世紀(jì)，累積了多樣化的染色體標(biāo)本制備方法。本研究主要在原先的體腔注射PHA空氣干燥法上做了細(xì)微調(diào)整[18]，將原先7 h內(nèi)的PHA作用時(shí)間延長(zhǎng)至28～30 h，制得較理想的染色體標(biāo)本。魚(yú)體內(nèi)注射適量的PHA可以起到增加細(xì)胞中期分裂相數(shù)目的作用[19]，但因養(yǎng)殖溫度、注射劑量和注射時(shí)間等多種因素的影響也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂相數(shù)量不足或直接導(dǎo)致試驗(yàn)魚(yú)死亡。經(jīng)反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)水溫在20～25 ℃時(shí)，按魚(yú)體重以10 μg/g的量注射1 mg/mL的 PHA，暫養(yǎng)28～30 h后得到的處于分裂中期的頭腎細(xì)胞較多。羅非魚(yú)染色體較小，長(zhǎng)度只有2～5 μm，需按魚(yú)體重以2 μg/g的量注射0.2 mg/mL的秋水仙素，秋水仙素作用時(shí)間控制在1.5～2 h，不宜過(guò)長(zhǎng)。作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則易導(dǎo)致染色體收縮過(guò)度，呈點(diǎn)狀，影響染色體的形態(tài)。在低滲中將時(shí)間延長(zhǎng)至1 h，每隔10 min上下輕輕翻動(dòng)離心管數(shù)下，使細(xì)胞充分懸浮并膨脹?？ㄖZ氏固定劑中冰醋酸具有脫嘌呤作用[20]，為避免染色體DNA受損，需把卡諾氏固定劑中的甲醇、冰乙酸的比例調(diào)整為4∶1，且每次固定時(shí)間縮短為15 min，有利于減小對(duì)染色體的傷害，保證染色體的完整性，并獲得背景干凈、染色體分散的標(biāo)本。此外，膜片的制備與普通玻片不同，膜片不能使用酒精燈火焰加熱。本團(tuán)隊(duì)摸索出滴片后，將膜片放在55 ℃烘箱中烘干10 s的方法，成功制備出高質(zhì)量的有絲分裂中期染色體膜片。膜片材質(zhì)極其輕薄，在操作時(shí)要小心謹(jǐn)慎，輕微的觸碰都會(huì)使膜破裂。

3.2　單染色體顯微分離技術(shù)優(yōu)化

激光顯微分離染色體和手工分離染色體是顯微分離單條染色體的方法。手工分離染色體對(duì)操作者的熟練度具有較高的要求，同時(shí)容易出現(xiàn)機(jī)械接觸，造成污染[21]。而染色體微分離、微克隆研究中應(yīng)嚴(yán)格避免外源污染[22]，本研究采用Leica LMD 6000正文激光顯微切割系統(tǒng)，染色體滴片在POL類型的鋼化薄膜上，用激光切割目標(biāo)染色體，在重力作用下脫落進(jìn)入收集管中。此操作不需借助外力，沒(méi)有人為接觸，避免了人為污染[23]。使用激光顯微系統(tǒng)分離單染色體，對(duì)目標(biāo)染色體進(jìn)行可視化切割，具有更高的準(zhǔn)確度，并能快速獲得大量染色體或染色體片段。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)目標(biāo)染色體周圍有其它染色體或細(xì)胞核成分時(shí)，可先通過(guò)微弱能量的激光束將干擾成分剔除 。若切割后發(fā)現(xiàn)被切下的承載目標(biāo)染色體的膜粘附在載片膜的背面時(shí)，需適當(dāng)增加激光能量輸出值，增大激光光圈，并降低激光發(fā)射速度，使其直接脫落在下方備好的收集管中。尼羅羅非魚(yú)的染色體屬于中、小型染色體，要比大部分細(xì)菌還小，為避免外源DNA的污染，LA-PCR擴(kuò)增等操作過(guò)程需在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，并對(duì)所用試劑、水進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌處理，嚴(yán)禁有任何的污染影響實(shí)驗(yàn)。

3.3　染色體文庫(kù)的驗(yàn)證與分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切，并用地高辛(DIG-High Prime)標(biāo)記尼羅羅非魚(yú)基因組 DNA 為探針，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Southern blot 雜交驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)的Southern 雜交結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)自尼羅羅非魚(yú)基因組，且陰性對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)信號(hào)，證明本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有被污染。此外，本研究應(yīng)用第二代羅非魚(yú)遺傳連鎖圖上定位的微衛(wèi)星做引物，并成功地在分離的1號(hào)染色體擴(kuò)增產(chǎn)物上擴(kuò)增出目的條帶。微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度特異性[24]，進(jìn)一步說(shuō)明分離的1號(hào)染色體擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)源的真實(shí)性。

本研究從尼羅羅非魚(yú)頭腎細(xì)胞入手，運(yùn)用單染色體的微分離與微克隆技術(shù)，成功建立尼羅羅非魚(yú)1號(hào)染色體的微克隆文庫(kù)構(gòu)建的方法，為該染色體的特異探針篩選及性別相關(guān)基因定位提供新的思路與方法，進(jìn)一步為更好地開(kāi)展尼羅羅非魚(yú)分子輔助育種提供技術(shù)支撐。