趙良杰，彭新亮，郭旭升

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南省漁業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，河南信陽(yáng) 464000)

微衛(wèi)星，又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)[1]，具有高穩(wěn)定性、高多態(tài)性、引物通用性、位點(diǎn)特異性、檢測(cè)方便和呈共顯性遺傳等特點(diǎn)[2]，其作為一種良好的分子標(biāo)記，在水產(chǎn)科學(xué)中被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用二代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)使得大規(guī)模開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星位點(diǎn)成為可能[3]，基于二代測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)平臺(tái)可以提供大量的微衛(wèi)星位點(diǎn)信息[2]。

銀鲴(Xenocyprisargentea)屬于鯉形目(Cypriniformes)鲴亞科(Xenocyprininae)鲴屬(Xenocypris)，是一種小型淡水經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于海南至黑龍江的國(guó)內(nèi)各江河、湖泊等水體[4]，是一種重要的淡水漁業(yè)捕撈對(duì)象[5]；由于其喜食底棲碎屑和著生藻類等食物，該種常常被作為水庫(kù)和池塘中凈化水質(zhì)和優(yōu)化養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)的工具魚[6]。但是，隨著近年來(lái)環(huán)境污染、水體富營(yíng)養(yǎng)化、過(guò)度捕撈等原因，銀鲴的野外種群數(shù)量也在快速下降。同時(shí)，盡管目前有人工繁殖銀鲴的相關(guān)報(bào)道[7,8]，但是該種的遺傳選育工作尚未開(kāi)展，僅見(jiàn)少量野生群體的遺傳學(xué)研究：肖武漢等[9]采用RFLP技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江和閩江流域的若干群體進(jìn)行遺傳分析；胡玉婷等[10]結(jié)合形態(tài)學(xué)和線粒體CytB基因?qū)蛾?yáng)湖及其鄰近水系的銀鲴進(jìn)行了遺傳學(xué)研究；劉軍等[11]采用線粒體COI序列對(duì)長(zhǎng)江、黑龍江以及錢塘江的銀鲴群體進(jìn)行了研究。目前仍然缺乏對(duì)于銀鲴遺傳資源狀況的全面認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)大規(guī)模的銀鲴微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，對(duì)于銀鲴遺傳資源的調(diào)查和分子標(biāo)記輔助育種工作的開(kāi)展具有重要意義。為了更好地保護(hù)和利用這一物種，本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)銀鲴的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行開(kāi)發(fā)和篩選，以期為銀鲴的遺傳資源進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用、銀鲴的分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)保護(hù)等工作提供技術(shù)支持。

1　材料和方法

1.1　樣品采集與DNA提取

32尾樣品采集自洞庭湖岳陽(yáng)湖區(qū)，形態(tài)鑒定依據(jù)《中國(guó)動(dòng)物志》[4]，體長(zhǎng)為(18.0±4.8) cm，取尾鰭置于95%乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室。取0.1 g尾鰭組織用滅菌雙蒸水洗去乙醇后，置于1.5 mL離心管中剪碎，采用酚/氯仿法提取DNA，后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，模板DNA保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星挖掘

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室自測(cè)數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)上傳至NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為SRP102051)，對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，組裝采用Trinity軟件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)完成。采用MISA(Microsatellite identification tool)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中微衛(wèi)星序列的分析，共鑒定6和類型的微衛(wèi)星序列：Mono-nucleotide(單堿基)，Di-nucleotide(雙堿基)，Tri-nucleotide(三堿基)，Tetra-nucleotide(四堿基)，Penta-nucleotide(五堿基)，Hexa-nucleotide(六堿基)。微衛(wèi)星序列的重復(fù)數(shù)閾值依次設(shè)置為10、6、5、5、5、5。

1.3　引物設(shè)計(jì)與合成

本研究選取四堿基，五堿基和六堿基微衛(wèi)星序列，使用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物長(zhǎng)度在20～23 bp，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～400 bp之間，共設(shè)計(jì)48對(duì)引物序列。引物由上海邁浦生物科技有限公司合成。

1.4　PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)

為驗(yàn)證各引物的擴(kuò)增效果，取4個(gè)模板DNA樣品，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。10 μL PCR反應(yīng)體系包括：10×Easy Taq Buffer 1 μL(20 mmol/L Mg2+)，dNTPs(0.25 mmol/L)1 μL，引物各0.5 μL(μmol/L)， Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA約為2 ng。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性60 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5　微衛(wèi)星位點(diǎn)分析和多態(tài)性驗(yàn)證

根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果，取上述32個(gè)樣品的模板DNA，對(duì)能夠成功擴(kuò)增的引物經(jīng)上海邁浦生物科技有限公司熒光標(biāo)記后，加入分子量?jī)?nèi)標(biāo)，利用ABI 3730XL 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。結(jié)合Genemapper 4.0進(jìn)行DNA片段長(zhǎng)度分析。確定具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。

1.6　數(shù)據(jù)分析

對(duì)上述獲得的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行種群遺傳參數(shù)的統(tǒng)計(jì)。利用PopGene32軟件計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)Na(allele number)，觀測(cè)雜合度Ho(observed heterozygosity)，期望雜合度He(expected heterozygosity)，香農(nóng)-威爾指數(shù)H(Shannon-Wiener Index)，同時(shí)進(jìn)行哈代-溫伯格平衡HWE(Hardy-Weinberg equilibrium)檢驗(yàn)。采用PIC_CALC 軟件計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量PIC(polymorphism information content)。

2　結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微衛(wèi)星挖掘

使用MISA軟件對(duì)銀鲴肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行微衛(wèi)星數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果如表1所示。根據(jù)重復(fù)單元的類型和重復(fù)次數(shù)，將不同的SSR位點(diǎn)進(jìn)行分類(表1)，其中數(shù)量最多的SSR類型為單核苷酸重復(fù)，比例占全部重復(fù)序列的65.86%，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)，比例分別為20.75%和12.39%，四、五、六核苷酸重復(fù)的SSR類型較少，所占比例分別為0.84%、0.10%以及0.07%。

表1　轉(zhuǎn)錄組中SSR標(biāo)記分析結(jié)果Tab.1　Output statistics of SSR makers in transcriptome

2.2　微衛(wèi)星序列的引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件的摸索

本研究中，共選擇了48個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，48個(gè)位點(diǎn)分別包括了40個(gè)四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)，3個(gè)五堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)，5個(gè)六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)(48個(gè)微衛(wèi)星序列已上傳至NCBI，序列號(hào)：MF693180-MF693227)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的48對(duì)引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)附表1。參考引物tm值，將PCR反應(yīng)的退火溫度均設(shè)置在55 ℃。對(duì)這48對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在105～378 bp之間，除DN24390-p4位點(diǎn)外，其余47個(gè)位點(diǎn)均獲得穩(wěn)定點(diǎn)的PCR產(chǎn)物(圖1)。對(duì)DN24390-p4進(jìn)行梯度PCR驗(yàn)證(溫度范圍為50～60 ℃)，仍未得到有效擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1　48對(duì)引物擴(kuò)增的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.1　PCR amplification results of 48 pairs of primers

2.3　微衛(wèi)星分型和遺傳多態(tài)性分析

從上述可以成功擴(kuò)增的47對(duì)引物中選取26個(gè)位點(diǎn)對(duì)洞庭湖銀鲴群體進(jìn)行分型和遺傳多樣性分析。發(fā)現(xiàn)其中5對(duì)引物表現(xiàn)出單態(tài)，21對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性。呈現(xiàn)多態(tài)性的21個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)見(jiàn)表2。21個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)中，四堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)為15個(gè)，五堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)為2個(gè)，六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)為4個(gè)。

根據(jù)21對(duì)多態(tài)性引物在該群體中的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，觀測(cè)雜合度(Ho)在0.187 5～0.968 8之間，期望雜合度(He)在0.228 7～0.916 2之間，香濃-威爾指數(shù)在0.468 7～2.520 1之間。多態(tài)信息含量(PIC)在0.210 9～0.893 7范圍內(nèi)，其中12個(gè)位點(diǎn)PIC值大于0.5，8個(gè)位點(diǎn)的PIC值在0.25～0.5之間，1個(gè)位點(diǎn)的PIC值小于0.25?？ǚ綑z驗(yàn)Hardy-Weinberg平衡結(jié)果表明，有6個(gè)位點(diǎn)(DN17679-p4，DN21251-p4，DN21454-p5，DN21477-p4，DN23059-p6，DN23506-p5)極顯著偏離(P<0.01)，其余15個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05) (表2)。

圖2　部分微衛(wèi)星位點(diǎn)(位點(diǎn)DN12410-p4)的分型鑒定峰圖Fig.2　The peak figure of partial microsatellite loci (Loci DN12410-p4)

表2　26位點(diǎn)在洞庭湖銀鲴群體的分型情況及其遺傳參數(shù)描述Tab.2　The genetic parameters description of 26 loci in the Dongting Lake population

3　討論

以往的資源調(diào)查和研究顯示[11]，長(zhǎng)江流域的銀鲴群體具有最高的種群遺傳多樣性和最廣泛的資源分布，是開(kāi)展銀鲴遺傳育種理想的種質(zhì)資源庫(kù)，其中湖南洞庭湖和江西鄱陽(yáng)湖是該種種群數(shù)量最為豐富的地區(qū)，長(zhǎng)江流域部分繁育場(chǎng)長(zhǎng)期將洞庭湖銀鲴群體作為親本開(kāi)展該種的人工繁育工作。本研究的結(jié)果也再一次證明，洞庭湖群體的銀鲴具有良好的種群遺傳多樣性，適合作為銀鲴遺傳育種的候選群體。

利用二代測(cè)序技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，是大規(guī)模開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的良好途徑。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，該方法已經(jīng)成為微衛(wèi)星位點(diǎn)開(kāi)發(fā)的主流方法之一。目前許多魚類利用該技術(shù)獲取了多態(tài)性良好的微衛(wèi)星序列：蔡磊等[12]對(duì)諸氏鯔蝦虎魚轉(zhuǎn)錄組序列中微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選，55對(duì)引物中有32對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性；龔詩(shī)琦等[13]對(duì)黃姑魚轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行了開(kāi)發(fā)驗(yàn)證，從38對(duì)引物中篩選出18對(duì)具有多態(tài)性的引物；岳華梅等[3]使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)興國(guó)紅鯉的微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了篩選，在20對(duì)引物中篩選出9對(duì)具有多態(tài)性的引物。上述研究均取得了較好的微衛(wèi)星篩選效果。本研究采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，同樣取得了較好的篩選效果，并從26個(gè)成功擴(kuò)增的位點(diǎn)中獲得了21個(gè)具有多態(tài)性的位點(diǎn)，多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選效率高于上述研究，上述研究微衛(wèi)星篩選所用群體或者是養(yǎng)殖群體(如諸氏鯔蝦虎[12]和興國(guó)紅鯉[3])，或者其篩選過(guò)程中采用的樣本數(shù)過(guò)少(黃姑魚的SSR開(kāi)發(fā)中僅用兩個(gè)野生群體和一個(gè)養(yǎng)殖群體的各5個(gè)樣本混合進(jìn)行篩選[13])；而本研究中，我們選取洞庭湖野生群體作為轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)和微衛(wèi)星多態(tài)性篩選的材料，且采用了較大的群體樣本數(shù)(32尾)，因此獲得了更多的多態(tài)性位點(diǎn)。本研究采用了四堿基以上微衛(wèi)星重復(fù)類型的位點(diǎn)作為篩選目標(biāo)。在一些物種例如兩棲有尾目和鱗翅目昆蟲的研究中，由于二堿基位點(diǎn)更容易受到微衛(wèi)星DNA家族的影響，因此其篩選效率要要低于四堿基位點(diǎn)[14,15]。盡管魚類目前尚未見(jiàn)微衛(wèi)星DNA家族的報(bào)道，但是考慮到兩堿基重復(fù)的微衛(wèi)星可能處于演化的初期，而四堿基以上重復(fù)的微衛(wèi)星序列則經(jīng)歷了較長(zhǎng)的演化歷史，其對(duì)于突變的積累更加穩(wěn)定[14]，目前已有一些魚類微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)如紅唇薄鰍[16]、圓口銅魚[17]等采用了四堿基以上的位點(diǎn)。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道在魚類中二堿基位點(diǎn)具有更好的多態(tài)性和更多的重復(fù)次數(shù)，但在本研究中，我們選取了四堿基，五堿基，六堿基位點(diǎn)依然獲得了很好的多態(tài)性。PIC檢測(cè)表明，26個(gè)驗(yàn)證位點(diǎn)中，具有多態(tài)性的位點(diǎn)有21個(gè)，占80.7%；其中高度多態(tài)位點(diǎn)(1>PIC>0.5)為12個(gè)，中度多態(tài)位點(diǎn)(0.5>PIC>0.25)8個(gè)，僅有1個(gè)位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)(PIC<0.25)。重復(fù)次數(shù)上，本研究的四堿基以上重復(fù)位點(diǎn)均在10次以下，紅唇薄鰍、中國(guó)明對(duì)蝦和圓口銅魚四堿基和五堿基重復(fù)也以10次以下的居多[16-18]，本研究的結(jié)果與其他的研究結(jié)果一致。另外，在具有多態(tài)性的21個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，有6個(gè)顯著偏離哈代-溫伯格平衡(HWE)。這些哈溫平衡偏離可能是由自然選擇、基因突變或者遺傳漂變等因素造成[3]。

本研究對(duì)于引物設(shè)計(jì)的成功率進(jìn)行了探討，首先轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)采用的樣本都來(lái)自洞庭湖，避免了種群遺傳差異帶來(lái)的引物設(shè)計(jì)失敗；其次，通過(guò)引物設(shè)計(jì)位置的選擇和同源比對(duì)，可以使得引物的設(shè)計(jì)成功率大大提升。本研究中，在48對(duì)引物中，有47對(duì)設(shè)計(jì)引物都成功獲得了微衛(wèi)星序列擴(kuò)增產(chǎn)物，引物設(shè)計(jì)成功率為97.9%。另外，有報(bào)道認(rèn)為四堿基以上重復(fù)位點(diǎn)可能具有比二堿基位點(diǎn)具有更好的側(cè)翼序列保守性[14]，這也是本研究引物設(shè)計(jì)成功率高的可能原因，但在魚類中，這一問(wèn)題尚需要進(jìn)一步探討。