王　凡，徐瑞杰，王　薇

(洛陽師范學院，河南洛陽 471022)

Keywords：triclosan;Cyprinuscarpio; antioxidant; growth

三氯生(triclosan，TCS)化學名稱為2，4，4-三氯-2-羥基-二苯醚，是一種羥二乙醚的三氯化衍生物[1]。作為一種廣譜抗菌劑，TCS具有低揮發(fā)性、高抗菌性、高耐熱性、耐酸堿性和易加工等特點，因此，其在洗漱用品、化妝用品、洗滌用品等個人生活用品中被廣泛應用[2，3]。隨著TCS的廣泛應用，在很多水體、沉積物、水生生物以及人類血漿、母乳中都能檢測到TCS的存在[4]。

TCS在污水處理廠不易被處理，因此污水處理廠的出水排放是TCS進入水環(huán)境的主要途徑，從而導致水生生物處于潛在的生態(tài)風險中。伍筱琳等[5]研究發(fā)現(xiàn)TCS明顯抑制小球藻光合色素含量的增加，影響其生長發(fā)育能力，表明TCS可在分子水平上產(chǎn)生毒性效應，影響酶和基因的正常表達及生理功能。陳建軍等[6]研究TCS對泥鰍可產(chǎn)生細胞毒性，損傷細胞以及組織，導致生物體組織器官產(chǎn)生畸變。TCS也可擾亂生物體的生殖系統(tǒng)、甲狀腺系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理功能[7]。此外，在日常飲用水的消毒過程中，消毒液中的氯會與TCS發(fā)生反應生成氯仿和醚類等有毒物質(zhì)，危害人體健康和生命安全[8]。TCS對硬骨魚類非特異性免疫及生長相關(guān)基因mRNA表達量影響的研究較少[9，10]。目前，已經(jīng)監(jiān)測到黃河受到不同程度TCS的污染[11]。本研究選用黃河鯉作為研究對象，研究TCS對雄性黃河鯉抗氧化酶及生長相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，為全面探討TCS對魚類的免疫及生長調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，同時為科學合理監(jiān)測TCS提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　研究對象

黃河鯉(Cyprinuscarpio)，體長7.8～9.9 cm，購自河南省黃河鯉良種場，暫養(yǎng)在60 L水族箱中，暫養(yǎng)期間用水為曝氣3 d的去氯自來水，并用充氣泵向水族箱中持續(xù)增氧，水溫(18±3) ℃，溶氧>5 mg/L，pH值為7.0±0.2，按時投喂且及時清除殘餌和糞便。暫養(yǎng)7 d后開始進行正式的相關(guān)實驗。

1.2　試驗試劑

TCS(美國Sigma，>98.0%純度)、二甲基亞砜(天津紫明化工有限公司)、總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本東洋紡生物科技有限公司)、BestarSybrGreenqPCRmastermix(德國DBI公司)、引物序列(華大基因合成)、無菌水等。

1.3　實驗設(shè)計

根據(jù)相關(guān)報道[12]和前期實驗結(jié)果，得出鯉96 h的LC50為0.8 mg/L。在此基礎(chǔ)上，按照等對數(shù)間距設(shè)置了3個TCS處理組，依次為1/20 LC50(0.04 mg/L)、1/10 LC50(0.08 mg/L)和1/5 LC50(0.16 mg/L)，同時設(shè)置空白對照組，每組20條。為使TCS濃度基本維持相對恒定水平，每24 h換一半的染毒液，染毒時間為42 d，整個暴露實驗期間無魚死亡現(xiàn)象。

1.4　樣本的制備

暴露實驗進行42 d后從每實驗組中隨機選取5條雄性黃河鯉解剖并取其肝胰臟，然后分別迅速保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后期抗氧化酶及生長相關(guān)基因表達的檢測。

1.5　抗氧化及生長相關(guān)基因表達的檢測

1.5.1引物序列

β- actin、谷胱甘肽還原酶(GSR)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-A(GSTA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、促生長素(GH)和促生長因子(IGF1)基因的引物序來自相關(guān)報道[13,14]，詳見表1。

表1　實時熒光定量PCR所用基因的特異性引物及其序列Tab.1　Specific primers and its sequences used for real-time PCR

1.5.2RT-qPCR

RNA的提取按照極速RNA提取試劑盒中的詳細步驟進行操作，提取出來的RNA質(zhì)量，用凝膠成像分析儀觀察并分析RNA提取結(jié)果，在此基礎(chǔ)上，并選取OD260/280為1.8～2.1的樣本用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，對反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用實時熒光定量PCR試劑盒根據(jù)基因相應引物進行擴增定量，反應條件為：95 ℃預變性2 min；循環(huán)條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s同時檢測熒光信號，40個循環(huán)反應；融解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循環(huán)0.5 ℃/循環(huán))86個循環(huán)。根據(jù)擴增曲線結(jié)果判斷目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率基本一致，然后利用2-ΔΔCt法進行計算相關(guān)基因的相對表達量。

1.6　數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 17.0軟件對實時熒光定量PCR結(jié)果進行分析，采用單因素方差分析法，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，各個濃度組之間的差異采用Duncan法多重比較，當P<0.05時，表示對照組與處理組有顯著差異；當P<0.01時，表示對照組與處理組有極顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　三氯生對雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化相關(guān)基因表達的影響

TCS對雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化酶相關(guān)基因表達量的影響見圖1，結(jié)果顯示，與對照組(0 mg/L)相比，TCS各處理組肝胰臟中的GSR和GSTA mRNA相對表達量顯著下調(diào)，TCS濃度和mRNA的表達量之間不存在劑量效應關(guān)系。0.08 mg/L的 TCS 能使GPx mRNA表達量顯著下調(diào)，0.04及0.16 mg/L TCS處理組中GPx mRNA的表達量與對照組相比較無顯著差異。結(jié)果表明，TCS能夠降低雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化酶相關(guān)基因mRNA表達量。

圖1　TCS對雄性黃河肝胰臟抗氧化酶相關(guān)基因mRNA表達的影響(A)谷胱甘肽還原酶(B)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶-A(C)谷胱甘肽過氧化物酶(n=5)Fig.1　Effect of TCS on expression of antioxidant enzyme related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GSR(B) GSTA(C) GPx(n=5)“*”表示與0mg/L(空白對照)該基因表達量相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與0mg/L相比該基因表達量相比差異極顯著(P<0.01)

2.2　三氯生對雄性黃河鯉肝胰臟抗生長相關(guān)基因表達的影響

TCS對雄性黃河鯉肝胰臟生長相關(guān)基因表達量的影響見圖2，與對照組相比較，TCS各處理組肝胰臟GH轉(zhuǎn)錄水平極顯著下調(diào)，且依次下調(diào)了93.1%、47.7%和79.0%。而TCS使雄性黃河鯉肝胰臟中IGF1轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)，且依次上調(diào)了263.3 %、100.2%和311.8%。結(jié)果表明，TCS顯著降低雄性黃河鯉肝胰臟促生長素mRNA表達量，而顯著增加促生長因子mRNA表達量。

3　討論

谷胱甘肽的變化與外源污染物的解毒機制相關(guān)，同時其氧化還原可以清除污染物暴露后產(chǎn)生的氧自由基[15，16]。谷胱甘肽相關(guān)的系列成份在生物體各器官中普遍存在，尤其在肝臟中含量居多。魚類谷胱甘肽相關(guān)的系列成分包括谷胱甘肽、GSR、GPx、GST[16]。GSR和GPx主要控制著還原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)之間的轉(zhuǎn)化。GSR在生物體組織中能夠催化GSSG與輔酶NADPH結(jié)合生成GSH。GPx是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的抗氧化酶，特異催化GSH對過氧化氫的還原反應，對由活性氧和羥自由基誘發(fā)的過氧化物及過氧化氫有極強的清除能力，從而保護生物大分子和生物膜結(jié)構(gòu)免受過氧化物的損傷。而GST是解毒系統(tǒng)第二階段的一種生物轉(zhuǎn)化酶，它同GPx一樣可以催化GSH轉(zhuǎn)化生成GSSG[17]。

圖2　TCS對雄性黃河肝胰臟生長相關(guān)基因mRNA表達量的影響(A)促生長素(B)促生長因子(n=5)Fig.2　Effect of TCS on expression of groth related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GH(B) IGF1(n=5)“*”表示與0mg/L(空白對照)該基因表達量相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與0mg/L相比該基因表達量相比差異極顯著(P<0.01)

本研究中，各濃度組的TCS使黃河鯉肝胰臟中GSR和GSTA mRNA水平顯著下調(diào)。TCS暴露組肝胰臟GPx的表達量也均低于對照組，且TCS在0.08 mg/L時GPx的表達量被顯著抑制。上述結(jié)果可能是由于TCS或者其代謝物已進入魚體肝臟內(nèi)產(chǎn)生了大量的自由基和過氧化物，這些自由基和過氧化物與GSH反應生成GSSG，GSH的過量消耗，超出了機體對GSH和GSSG之間轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)范圍，從而導致GSR被顯著抑制。同時肝胰臟為了迅速解毒及清除過多的自由基和過氧化物，致使GPx和GSTA會進一步特異性催化GSH來保護機體受到的損傷，加速了GSH和GSSG之間不平衡關(guān)系，進而導致GPx和GSTA也被抑制。這與苯并芘和2,2′,4,4′,5-五溴聯(lián)苯醚暴露對哺乳類動物肝臟GSR影響[18，19]，氯化三丁基錫對黑鯛肝臟GPx的影響[20]，十溴聯(lián)苯醚對鯽肝胰臟GST影響[16]的結(jié)果相一致。但也有研究證實了TCS誘導了虹鱒和劍尾魚GST的mRNA水平[9，10]，十溴聯(lián)苯醚致使鯽肝胰臟GSR和GPx活性顯著升高，鎘誘導了黃顙魚肝臟中GSR和GPx活性[21]。上述結(jié)果的差異可能與物種的類別、污染物的濃度及暴露時間相關(guān)?？傊?，從本研究中TCS對黃河鯉肝胰臟的谷胱甘肽相關(guān)系列成分影響的結(jié)果分析可知，TCS對雄性黃河鯉肝胰臟的抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生了一定程度損傷。

GH 基因在動物個體早期發(fā)育過程中起著重要作用，與幼體出生后的生長和存活密切相關(guān)[22]，它通過與生長激素受體結(jié)合起作用。GH 的促生長發(fā)育作用除直接作用于靶細胞的生長激素受體外，主要是通過類胰島素生長因子(IGFs)介導而起作用，IGF1直接作用于骨骼、肌肉等靶器官，對動物胚胎及出生后的生長發(fā)育起著更為直接的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)TCS使GH的mRNA表達量顯著降低，而對IGF1的mRNA表達量顯著升高，表明TCS干擾了雄性黃河鯉生長相關(guān)基因mRNA的表達，從而干擾了其正常生長的進程。