劉恩秀，朱仙珍，李　云，吳榮華，英士娟，楊　帆，胡　鑫，郭　鶴

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶400715；2.淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715；3.水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)，又稱生長(zhǎng)分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF-8)，屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)超家族成員，是動(dòng)物肌肉發(fā)育和生長(zhǎng)過程中的負(fù)調(diào)控因子[1]。MSTN的N-端有一段由非親水性氨基酸序列構(gòu)成的信號(hào)肽；C-末端包含9個(gè)保守的半胱氨酸的活性區(qū)，靠分子間的二硫鍵形成二聚體發(fā)揮功能[2]；緊挨著C-末端的活性區(qū)有4個(gè)氨基酸組成的蛋白酶加工水解位點(diǎn)(RSRR)[3]。

1997年，McPherron等[4]在對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該基因具有抑制肌肉發(fā)育的生物學(xué)特性。隨后，并以小鼠保守的C-端cDNA為探針篩選不同物種的骨骼肌cDNA文庫(kù)，克隆了大鼠、人、豬等的cDNA序列。在魚類的研究中，斑馬魚(Daniorerio)[5]、鯉魚(Cyprinuscarpio)[6]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[7]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[8]、刀鱭(Coilianasus)[9]、縮骨鯽(Carassiusauratussoguvar)[10]等的MSTN基因已經(jīng)相繼被克隆。研究表明哺乳動(dòng)物的MSTN基因主要在骨骼肌中表達(dá)，而魚類的MSTN基因除了在骨骼肌表達(dá)以外，還可在多個(gè)組織中表達(dá)。

巖原鯉(Procyprisrabaudi(Tchang))屬鯉形目鯉科鯉亞科原鯉屬[11]，主要分布于長(zhǎng)江上游水系干、支流及金沙江中下游的江河中[12]，是長(zhǎng)江上游珍稀特有經(jīng)濟(jì)魚類。由于過度捕撈及生境變化，巖原鯉自然種群數(shù)量急劇減少，已被列為易危物種[13]。近期巖原鯉規(guī)?；斯し别B(yǎng)已經(jīng)成功[14-15]，但是其生長(zhǎng)較慢，養(yǎng)殖周期長(zhǎng)，限制了其產(chǎn)業(yè)化推廣。近年來對(duì)巖原鯉的研究主要有HSC70[16]、促性腺激素[17]等基因的克隆，尚未見對(duì)巖原鯉MSTN基因的克隆。本研究通過對(duì)巖原鯉MSTN基因克隆、組織表達(dá)及饑餓脅迫下巖原鯉MSTN基因表達(dá)變化研究，了解營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)其生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理，可為該魚的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)調(diào)控研究提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

巖原鯉購(gòu)自重慶市萬(wàn)州水產(chǎn)研究所，每尾體重約100 g，將試驗(yàn)魚活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后先暫養(yǎng)2 d，然后選用健康活潑、體格健壯的進(jìn)行試驗(yàn)。

Trizol試劑、M-MLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒、膠回收試劑盒、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA Ligase、 Taq DNA 聚合酶、DNA maker均購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.2　方法

1.2.1總RNA提取及MSTN基因克隆

采用Trizol法提取巖原鯉肌肉總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)總RNA的濃度后，根據(jù)M-MLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒說明，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)斑馬魚(Daniorerio)MSTN基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物MSTN- f1、MSTN- S1，MSTN- f2、MSTN- S2，MSTN- f3、MSTN- S3(表1)，以肌肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得基因片段。膠回收純化后，連接到 PMD18-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，菌液PCR擴(kuò)增后送往華大基因測(cè)序。

1.2.2序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析

獲得基因序列后NCBI 在線BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)分析巖原鯉MSTN與其他同源蛋白的相似性。CLUSTALW(http://www.genome.jp/tools/clustalw/)和 GeneDoc 軟件進(jìn)行氨基酸的多序列比對(duì)。運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)基因和蛋白質(zhì)序列多重比對(duì)和同源性分析。用MEGA 4.0生物學(xué)軟件，通過Neighbor-Joining算法，Bootstrap重復(fù)1 000次建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析

根據(jù)已克隆出的巖原鯉MSTN序列信息，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物為β-actin S和β-actin A(表1)，用MSTN 3’末端的基因特異引物對(duì)巖原鯉不同組織進(jìn)行半定量RT-PCR分析。

1.2.4饑餓再投喂對(duì)巖原鯉MSTN的表達(dá)調(diào)控

將360尾試驗(yàn)巖原鯉隨機(jī)分成兩個(gè)組(試驗(yàn)組和對(duì)照組)，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)，組間初始體重差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)開始后，試驗(yàn)組饑餓處理15 d，之后恢復(fù)投喂9 d，對(duì)照組正常投喂。水溫(25±2)℃， pH 6.5～6.8，DO 5.6～8.8 mg/L。分別在饑餓0、2、4、6、9、12、15 d，以及恢復(fù)投喂的3 d(18 d)、6 d(21 d)和9 d(24 d)早上投喂前取樣。試驗(yàn)組、對(duì)照組的三個(gè)重復(fù)缸中隨機(jī)各抽取3尾魚，取其肌肉組織，提取RNA，半定量RT-PCR檢測(cè)其不同時(shí)間段MSTN基因的表達(dá)含量。

表1　實(shí)驗(yàn)中所用引物Tab.1　Primers used in the experiment

2　結(jié)果與分析

2.1　巖原鯉MSTN基因cDNA序列分析

3條特異性擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序后拼接，獲得了巖原鯉MSTN基因1 547 bp的cDNA序列(GenBank登錄號(hào):GU553283)。BLAST檢索同源序列顯示，該序列與魚類等脊椎動(dòng)物MSTN cDNA有較高的同源性。該cDNA序列包括23 bp的5′非編碼區(qū)序列(5′UTR)和396 bp的3′非編碼區(qū)序列(3′UTR)。開放閱讀框(ORF)為1 128 bp，編碼的375個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成前體蛋白，其分子質(zhì)量預(yù)測(cè)值為42.1 kd，等電點(diǎn)pI為6.27。22個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成信號(hào)肽，信號(hào)肽切割位點(diǎn)在Gly22和Asp23之間。前體蛋白序列中有一個(gè)蛋白酶水解位點(diǎn)RIRR，位于第263～266位氨基酸。蛋白酶水解位點(diǎn)之后的C端肽段區(qū)域?yàn)镃端活性區(qū)，含有9個(gè)保守的Cys殘基。試驗(yàn)所得巖原鯉的MSTN cDNA核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列見圖1。

圖1　巖原鯉MSTN的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序Fig.1　Nucleotide sequence encoding the MSTN of P.rabaudi and the deduced amino acid sequence

氨基酸序列位于核苷酸序列下面。起始密碼子、終止密碼子加粗表示；信號(hào)肽用加下劃線表示；酶切位點(diǎn)用方線表示；半胱氨酸殘基用陰影表示

2.2　同源性及進(jìn)化關(guān)系分析

由 NCBI 獲得其他相關(guān)物種的MSTN基因序列。從表2中可以直觀地看到，巖原鯉MSTN編碼區(qū)氨基酸序列與鯉科魚類的同源性最高，與鯉魚同源性高達(dá)98.4%；與南亞野鯪同源性達(dá)98.1%；與稀有鮈鯽同源性達(dá)98.1%；與草魚、斑馬魚、厚頜魴的氨基酸序列同源性分別為97.3%、96.3%、97.9%。與其它魚類的同源性都在80%左右，而與鳥類、哺乳類的同源性相對(duì)較低。運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)MSTN氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)巖原鯉MSTN氨基酸序列與許多物種的MSTN氨基酸序列具有較高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，巖原鯉與來自鯉科魚類的鯉魚、稀有鮈鯽、厚頜魴、草魚、斑馬魚、南亞野鯪的MSTN蛋白組成一個(gè)緊密的亞群，而與東方紅鰭鲀、美洲鱸、石首魚的MSTN蛋白亞群距離比較遠(yuǎn)(圖2)。

表2　巖原鯉與其他物種MSTN核苷酸和氨基酸同源性比較Tab.2　Homology analysis of MSTN cDNA sequences and amino acid among P.rabaudi and other animals

圖2　巖原鯉與其它物種MSTN的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2　Phylogenrtic tree based on MSTN deduced amino acids of P.rabaudi and other species

2.3　MSTN mRNA在不同組織中的表達(dá)分析

巖原鯉MSTN 的組織RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果表明(圖3)，該基因在肌肉和腦組織中表達(dá)較高，在眼、腸、心、鰓、腎和頭腎組織中有少量表達(dá)，而在肝胰臟、脾臟組織中未見表達(dá)。以β-肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閷?duì)照，同時(shí)進(jìn)行了不同組織的半定量RT-PCR 檢測(cè)，在所檢測(cè)的組織樣品中均得到β-肌動(dòng)蛋白基因的特異擴(kuò)增帶。

圖3　巖原鯉不同組織MSTN mRNA的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3　The RT-PCR results of MSTN mRNA in different tissues of P.rabaudi上圖為巖原鯉MSTN ,下圖為巖原鯉β-肌動(dòng)蛋白

2.4　饑餓再投喂對(duì)巖原鯉肌肉組織MSTN表達(dá)含量的影響

半定量RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間段MSTN表達(dá)含量，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4。凝膠成相系統(tǒng)分析電泳結(jié)果，用SPSS軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖5所示，饑餓2 d、4 d后巖原鯉肌肉組織中MSTN基因表達(dá)含量差異不顯著(P>0.05)；饑餓6 d、9 d、12 d時(shí)肌肉組織中MSTN基因表達(dá)含量與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，且MSTN基因表達(dá)含量逐漸增高；繼續(xù)饑餓至15 d時(shí)，MSTN基因表達(dá)含量達(dá)到最高值；在饑餓15 d后對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行投餌，結(jié)果表明在投餌后3 d(即試驗(yàn)第18 d)肌肉組織中MSTN基因表達(dá)含量急劇下降，達(dá)到最低值；投餌后6 d、9 d(即試驗(yàn)第21 d、24 d)MSTN表達(dá)含量升至正常水平，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明饑餓可導(dǎo)致肌肉組織中MSTN表達(dá)含量顯著升高，重新投喂餌料后3 d內(nèi)肌肉組織中MSTN基因表達(dá)含量急劇下降，3～6 d內(nèi)MSTN基因表達(dá)含量逐漸恢復(fù)到正常水平。

圖4　RT-PCR分析巖原鯉試驗(yàn)組(A)和對(duì)照組(B)肌肉組織中MSTN mRNA表達(dá)水平Fig.4　RT-PCR analysis of MSTN mRNA expression in muscle of test group(A)and control group(B)MSTN序列長(zhǎng)度為601 bp，β-actin序列長(zhǎng)度為397 bp

圖5　饑餓對(duì)巖原鯉肌肉組織中MSTN表達(dá)含量影響Fig.5　Relative MSTN mRNA expression levels of P.rabaudi in muscle subjected to feed deprived(FD)0、2、4、6、9、12、15表示饑餓時(shí)間段，18、21、24 d表示在饑餓15 d后恢復(fù)投餌時(shí)間段，*表示差異顯著，**表示差異極顯著

3　討論

研究表明，雖然鳥類、哺乳類與魚類的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但MSTN基因的同源性較高，其相似度都在60%以上，尤其是在C-末端成熟的蛋白活性區(qū)域，具有更高保守性。氨基酸序列的變化，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的變化，C-末端是生物活性區(qū)，尤其是其中的半胱氨酸，屬于保守氨基酸，變異會(huì)導(dǎo)致功能的重大改變[18]。序列上的保守性特別是活性區(qū)域的保守性暗示著魚類MSTN基因在功能上與哺乳類MSTN基因可能有某種程度的相似性，不同物種間的MSTN可能是由相同的祖先進(jìn)化而來的[19]。

RT-PCR 結(jié)果表明，巖原鯉MSTN基因在肌肉和腦組織中表達(dá)較多，這與斑馬魚[20]、鯉魚[6]、草魚[21]、團(tuán)頭魴[22]等的研究結(jié)果一致。而巖原鯉MSTN基因在眼、腸、心、鰓、腎和頭腎等組織中有少量表達(dá)，在肝胰臟和脾臟中未見表達(dá)，這又與這些在分類地位上很相近的魚有所區(qū)別[23]，表明MSTN基因表達(dá)的組織特異性較強(qiáng)。與哺乳動(dòng)物相比，魚類MSTN基因組織分布較廣泛，研究表明哺乳動(dòng)物MSTN基因主要在肌肉組織中表達(dá)[1]，而在其他組織中表達(dá)較少。

饑餓再投喂實(shí)驗(yàn)表明，巖原鯉肌肉組織中MSTN基因表達(dá)含量隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，恢復(fù)投喂后MSTN基因表達(dá)含量急劇下降，6 d后恢復(fù)至正常水平。這與Terova等[24]對(duì)鱸魚和韓明星等[25]對(duì)大黃魚的研究一致。Li等[26]對(duì)巖原鯉饑餓再投喂實(shí)驗(yàn)表明隨著饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，巖原鯉肌肉組織中蛋白質(zhì)含量、RNA/DNA比率逐漸降低，恢復(fù)投喂后表現(xiàn)出不同程度的補(bǔ)償性增長(zhǎng)。肌肉是魚體最大的組織，也是蛋白質(zhì)合成的主要組織，MSTN是肌肉生長(zhǎng)的上游調(diào)控因子，饑餓脅迫下，魚體缺乏外源食物供能，巖原鯉通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MSTN基因的表達(dá)，激活其信號(hào)通路，從而上調(diào)肌肉組織中MSTN的表達(dá)量來抑制肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，盡量減少用于肌肉細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的能量消耗，使魚體的儲(chǔ)能用于維持基本的生命活動(dòng)。

綜上，本研究克隆了巖原鯉肌肉生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因MSTN的cDNA序列，其主要表達(dá)在肌肉和腦組織，饑餓顯著上調(diào)肌肉組織MSTN的轉(zhuǎn)錄水平，恢復(fù)投喂顯著下調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平，表明MSTN的表達(dá)對(duì)營(yíng)養(yǎng)攝入非常敏感，提示其可能是能量攝入與生長(zhǎng)調(diào)控的主要調(diào)節(jié)分子，這些結(jié)果可為巖原鯉的營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)調(diào)控研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。