周康奇，潘賢輝，劉　奕，牟希東，鄭曙明，胡隱昌，宋紅梅，楊葉欣

(1.西南大學(xué)，重慶北碚400715；2.農(nóng)業(yè)部休閑漁業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省現(xiàn)代休閑漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州510380)

卵黃蛋白原(Vitellogenin，Vtg)的合成及其在卵黃蛋白原受體(Vitellogenin receptor，Vtgr)中的胞吞方式，在卵生動物繁殖過程中起著至關(guān)重要的作用。目前，對于魚類肝組織Vtg合成的激素驅(qū)動機(jī)制已被廣泛研究，并被證明受17β-雌二醇(E2)調(diào)控。E2通過激發(fā)雌激素受體(ER)進(jìn)行信號傳導(dǎo)，刺激肝細(xì)胞合成Vtg并釋放到血液中。然后，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)卵巢，被卵母細(xì)胞膜微絨毛上分布的Vtgr蛋白通過胞吞作用攝入，從而為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[1，2]。研究結(jié)果表明卵母細(xì)胞膜內(nèi)確實(shí)存在表面受體Vtgr，其主要功能在于結(jié)合并以胞吞形式為卵母細(xì)胞攝取Vtg，從而為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)[3-5]。目前，大部分學(xué)者對非洲爪蟾(Xenopuslaevis)等[6-8]卵生脊椎動物的vtgr和Vtgr蛋白研究已較為深入，包括vtgr結(jié)構(gòu)差異、vtgr的表達(dá)特征、蛋白功能和作用途徑等方面。而對克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)等[9-11]甲殼動物與昆蟲則主要集中于對vtgr結(jié)構(gòu)和功能的研究。

雙須骨舌魚(Osteoglossumbicirrhosum)隸屬于骨舌魚目(Osteoglossiformes)骨舌魚科(Osteoglossidae)骨舌魚屬(Osteoglossum)，俗稱銀龍魚(SilverArowana)，分布于南亞馬遜河流域，屬于亞洲國家名貴特種觀賞魚之一[12]。迄今為止，關(guān)于雙須骨舌魚研究多在性腺組織學(xué)觀察[13]、SSR引物篩選[14]、染色體核型分析[15]和性別相關(guān)基因amh功能分析[16]等方面，其目的都在于探索一種有效鑒定性別的方法。而本次研究雙須骨舌魚性腺發(fā)育中的vtgr基因及其表達(dá)特征，旨在進(jìn)一步了解vtgr基因特點(diǎn)，進(jìn)而為性別鑒定方法的建立提供思考。本研究擬通過克隆獲得vtgr全序列，探究vtgr在雌雄魚上的組織表達(dá)特征，并對性腺發(fā)育至Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期的雌雄魚vtgr表達(dá)量進(jìn)行分析，探討兩者間的變化規(guī)律，從分子水平上為下一步研究雙須骨舌魚性腺的發(fā)育機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時，該數(shù)據(jù)將與本實(shí)驗(yàn)室對vtg的研究結(jié)果相對應(yīng)，進(jìn)一步分析兩者在雙須骨舌魚性腺發(fā)育過程中的相互作用。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

本研究共用雙須骨舌魚24尾，其中雌雄各12尾，Ⅱ期雌雄各3尾：體長(40.63±0.80) cm，體重(361.23±10.4) g；Ⅲ期雌雄各6尾：體長(43.23±2.18) cm，體重(604.27±11.24) g；Ⅳ期雌雄各3尾：體長(45.62±1.74) cm，體重(689.33±10.21) g。性腺發(fā)育分期參考汪學(xué)杰等[13]關(guān)于雙須骨舌魚性腺發(fā)育分期的研究結(jié)果。實(shí)驗(yàn)用魚均來源于珠江水產(chǎn)研究所觀賞魚基地。

rTaq，PrimrScript RT Reagebt Kit (with gDNA Eraser)，Smarter Race5′/3′Kit Components，E.Coli DH5α，pMD19-T Vector，SYBR Green Master Mix等購自于TAKARA公司；TRlzol Reagent，Tissue RNA kit等購自于OMEGA公司，TIANgenl Midi Purification Kit，TIANprep Mini Plasmid Kit購自于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

提取性腺發(fā)育至Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅵ期雙須骨舌魚卵巢和精巢組織總RNA。此外，隨機(jī)挑選6尾2齡雙須骨舌魚(性腺發(fā)育Ⅲ期，雌雄各3尾)，分別提取性腺、肝、脾、腎、鰓、心、頭腎、腦等8種組織總RNA，然后用BioTek CytationTM5多功能酶標(biāo)儀測定總RNA濃度和純度，以及1.0%瓊脂糖電泳檢測總RNA完整性。各取1.2 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA樣品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2vtgr基因克隆

根據(jù)雙須骨舌魚vtgr的轉(zhuǎn)錄組拼接序列，并參考GenBank中美麗硬仆骨舌魚(Scleropagesformosus)、金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)、紅腹水虎魚(Pygocentrusnattereri)、大西洋鮭(Salmosalar)、斑馬魚(Daniorerio)等魚類vtgr基因序列設(shè)計雙須骨舌魚vtgr基因核心序列引物，分別為vtgr-F1/R1和vtgr-F2/R2(表1)。25 μL PCR反應(yīng)體系含有18.9 μL ddH2O，2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，各0.4 μL上下游引物(10 μmol/L)，0.6 μL cDNA，0.2 μL rTaq 。PCR條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆測序。

用VectorNTI軟件將2對引物測序結(jié)果進(jìn)行比對，并將其拼接得到vtgr核心序列。然后根據(jù)該序列分別設(shè)計的5′RACE和3′RACE巢式PCR引物vtgr-5′n、vtgr-5′w與vtgr-3′w、vtgr-3′n(表1)，擴(kuò)增vtgr的5′端和3′端序列。將vtgr核心序列、5′端和3′端序列經(jīng)VectorNTI軟件拼接，獲得完整的雙須骨舌魚vtgrcDNA全序列(圖1)。

表1　實(shí)驗(yàn)中用的引物Tab.1　Primers used in this study

1.2.3基因序列分析

運(yùn)用NCBI內(nèi)ORF Finder工具對vtgr全序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)查找，并用BioEdit軟件翻譯ORF。用ProtParam 軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)(http://web.expasy.org/protparam/)；用TMHMM軟件進(jìn)行跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；用Prabi SOPMA軟件進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)；用SWISS-MODEL軟件進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(https://swissmodel.expasy.org/)；用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)軟件進(jìn)行親疏水性分析；用SignalP 軟件分析信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)；用NetNGlyc 1.0 Server軟件進(jìn)行糖基化分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)；用NetPhos 2.0 Server軟件進(jìn)行磷酸化分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)；用ClustalX1.83軟件和Clustal Omega軟件進(jìn)行氨基酸序列多序列比對(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)；用SMART軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)；用NCBI中的BLASTP程序進(jìn)行基酸序列同源性檢索，并用MAGE 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(從GenBank選用vtgr編碼氨基酸序列見表2)。

圖1　雙須骨舌魚vtgr克隆策略Fig.1　Clone strategy of vtgr gene in O.bicirrhosum圖中F1/R1和F2/R2都與表1引物對應(yīng)

1.2.4組織表達(dá)

選用雙須骨舌魚GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列引用王且魯?shù)萚16](表1)。根據(jù)測得的雙須骨舌魚vtgrcDNA全序列設(shè)計一對熒光定量PCR(qRT-PCR)引物vtgr-RT-F和vtgr-RT-R(表1)。分別將以上2對引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD19-TVector并轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受細(xì)胞中，經(jīng)測序、比對后，將陽性克隆菌落進(jìn)行過夜培養(yǎng)，再進(jìn)行質(zhì)粒提取。

用BioTek CytationTM5多功能酶標(biāo)儀測定質(zhì)粒濃度，然后對其以10倍梯度稀釋，共設(shè)12個梯度。用QuantStudio6 Flex儀器制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，若R2>0.99，斜率在-3.0～-3.6之間，則說明標(biāo)準(zhǔn)曲線制作合格，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢測。qRT-PCR體系共20 μL，包括10 μL SYBR Green Master Mix，1 μL cDNA，8 μL ddH2O，各0.5 μL上下游引物(10 μmol/L)。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；溶酶曲線：95 ℃， 15 s；60 ℃，2 min；95 ℃，15 s；每個樣品重復(fù)3次。用QuantStudioTM Real-Time PCR Solftware v1.2軟件計算每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增后的拷貝數(shù)(Qty)，各樣品的目的基因和內(nèi)參基因Qty值之比即為目的基因相對表達(dá)量。用excel作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較分析顯著性差異。

表2　用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種Tab.2　Species used to construct phylogenetic trees

2　結(jié)果與分析

2.1　vtgr全序列分析

用VectorNTI軟件拼接得到vtgrcDNA全序列為2 841 bp(登錄號：MG266905)，ORF為2 556 bp，共851個編碼氨基酸。序列兩端分別存在26 bp的5′非編碼區(qū)(untraslated region，UTR)和258 bp的3′UTR，且3′端含有典型的poly(A)尾和一段加尾序列AATAAA。經(jīng)ProtParam和ProtScale 軟件預(yù)測該基因的蛋白分子質(zhì)量為93.6 ku，等電點(diǎn)pI為4.78，分子式為C3984H6212N1136O1303S84，親水性平均系數(shù)為-0.409，表明親水性強(qiáng)。

2.2　vtgr編碼氨基酸序列生物信息學(xué)分析

2.2.1信號肽與跨膜區(qū)域分析

用SignalP 4.1 軟件分析結(jié)果顯示，該序列信號肽區(qū)域分值(S)為0.243，信號肽剪切位點(diǎn)分值(C)為0.460，剪切位點(diǎn)分值(Y)為0.938，mean S和D分別為0.851、0.671，高于臨界值0.450，表明該蛋白存在信號肽，并位于N端的1～26位氨基酸區(qū)域(圖2)。經(jīng)TMHMM軟件分析表明，該序列含有一個跨度為16個氨基酸的跨膜區(qū)域(TM)，位于第589至604位氨基酸(圖3)，說明該蛋白為跨膜蛋白。

圖2　vtgr編碼蛋白質(zhì)序列信號肽Fig.2　The vtgr encoded a protein sequence signal peptide

2.2.2糖基化位點(diǎn)與磷酸化位點(diǎn)分析

用NetNGlyc 1.0軟件分析發(fā)現(xiàn)該序列含有4個N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第17、129、359、570位氨基酸。N端糖基化位點(diǎn)的存在對蛋白修飾和調(diào)節(jié)功能具有重要作用。用NetPhos 2.0軟件分析表明該序列共含有32個磷酸化位點(diǎn)，其中23個絲氨酸(Ser)，5個蘇氨酸(Thr)和4個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)。

2.2.3結(jié)構(gòu)域分析

用Smart軟件分析顯示該序列含有8個A型低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域(Low-density lipoprotein receptor domain class A，LDLa)，2個類表皮生長因子結(jié)構(gòu)域(Epidermal growth factor-like domain，EGF)，1個鈣結(jié)合類表皮生長因子(Calcium-binding EGF-like domain，EGF-CA)，5個低密度脂蛋白受體YWTD結(jié)構(gòu)域(Low-density lipoprotein-receptor YWTD domain，LY)(圖3)。

圖3　vtgr基因編碼蛋白質(zhì)序列保守域Fig.3　The vtgr gene encodes conserved domains of protein sequences

2.2.4二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用PredictProtein軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，vtgr不含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，主要由β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，各占27.17%和72.83%，并含有跨膜區(qū)域與HMTMM預(yù)測結(jié)果相同(圖4-A)，含有豐富β-折疊在蛋白質(zhì)肽鏈中有交聯(lián)作用，可推測該蛋白結(jié)構(gòu)化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定。同時，SWISS-MODEL軟件預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)結(jié)果也顯示該蛋白不含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，C端具有β-折疊和無規(guī)則卷曲組成的球型空間結(jié)構(gòu)(圖4-B)。

圖4　vtgr編碼氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)Fig.4　The secondary structure and tertiary structure of vtgr encoded amino acid sequence (A)：藍(lán)色的為β-折疊結(jié)構(gòu)；紅色和空白處為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu);(B):E為β-折疊結(jié)構(gòu)；L為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu).

2.3　vtgr編碼蛋白序列同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3.1vtgr編碼蛋白序列同源性分析

用ClustalX1.83和Clustal Omega軟件進(jìn)行氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，雙須骨舌魚vtgr與美麗硬仆骨舌魚相似度最高，達(dá)到95.96%；其次與大西洋鮭、虹鱒、紅腹水虎魚、白斑狗魚、斑馬魚等相似度都超過80%，分別為87.02%、86.97%、86.9%、85.61%和85.48%；與小家鼠、智人、原雞相似度分別是72.23%、71.68%和70.99%，而與非洲爪蟾的相似度最低，為52.95%(圖5)。此外，本研究將雙須骨舌魚vtgr與塞內(nèi)加爾舌鰨兩種vldlr結(jié)構(gòu)型進(jìn)行氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，雙須骨舌魚vtgr基因結(jié)構(gòu)和塞內(nèi)加爾舌鰨vldlr2相同都缺少O-聯(lián)糖結(jié)構(gòu)域(O-glycan domain)，且存在1個胞漿區(qū)(Cytoplasmic domain，CD)(圖6)。

圖5　vtgr編碼蛋白序列比對相似度百分比矩陣圖Fig.5　The similarity percentage matrix of vtgr gene encoding protein sequence 每一列表示其他物種與其中一種物種(100%)進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)序列比對獲得的相似度結(jié)果；紅框表示其他物種與雙須骨舌魚進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)序列比對獲得的相似度結(jié)果。

圖6　vtgr編碼氨基酸序列比對Fig.6　Sequence alignment of vtgr coding protein方框內(nèi)依次為8個LDLa；2個EGF；1個EGF-CA；5個LY；1個TM；1個CD。O-glycan存在于塞內(nèi)加爾舌鰨vldlr1。

2.3.2vtgr系統(tǒng)發(fā)育樹分析

運(yùn)用MEGE5.2軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹分析雙須骨舌魚vtgr與其他物種親緣關(guān)系結(jié)果表明，雙須骨舌魚與美麗硬仆骨舌魚聚為一支，該結(jié)點(diǎn)的自引導(dǎo)值為100%，表明二者親緣關(guān)系最近，這與傳統(tǒng)魚類學(xué)分類結(jié)果一致；而與斑馬魚、虹鱒、牙鲆、銀大馬哈魚等魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖7)。

2.4　vtgr在不同組織和發(fā)育性腺時期的表達(dá)量分析

運(yùn)用qRT-PCR方法檢測雙須骨舌魚vtgr在8個組織中的表達(dá)量(圖8-A)，結(jié)果表明vtgr在8個組織中均有表達(dá)，其中在雌雄魚性腺中表達(dá)量最高，其次是肝和腎。在雌魚卵巢和雄魚精巢組織中vtgr相對表達(dá)量都顯著高于鰓、肝、脾、腎、心、頭腎和腦7個組織(P<0.05)，且這7個組織間無顯著差異(P>0.05)。將雌雄個體相同組織vtgr表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，雌魚的肝和脾顯著高于雄魚(P<0.05)，而性腺、鰓、腎、心、頭腎和腦6個組織則均無顯著差異(P>0.05)。vtgr在不同發(fā)育時期的雌雄魚性腺中的表達(dá)量變化進(jìn)見圖8-B。在Ⅱ期卵巢中vtgr的表達(dá)量顯著高于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)，但雄魚3個時期之間無顯著差異(P>0.05)。性腺發(fā)育Ⅱ和Ⅲ期雌魚vtgr表達(dá)量顯著高于雄魚(P<0.05)，而Ⅳ期則無顯著差異(P>0.05)。

圖7　基于vtgr編碼氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹Fig.7　Phylogenetic tree constructed based on vtgr gene coding amino acid sequences各支上數(shù)值表示經(jīng)1 000次運(yùn)算得到的引導(dǎo)值；標(biāo)尺表示每單位氨基酸的變化率。

圖8　不同組織和時期的vtgr相對表達(dá)量Fig.8　The relative expression of vtgr in different tissues and periods不同的小寫字母表示雌魚不同組織和時期顯著差異(P<0.05)，相同則無顯著差異(P>0.05)；不同大寫字母表示雄魚不同組織和時期顯著差異(P<0.05)，相同則無顯著差異(P>0.05)；*表示雌雄魚同一組織和時期顯著性差異(P<0.05)，并標(biāo)于高的一端。

3　討論

本研究是用卵巢組織總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過RACE方法克隆獲得雙須骨舌魚vtgrcDNA 全序列，并運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件對該基因編碼氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列含有典型的LDLR基因超家族的脂蛋白受體的結(jié)構(gòu)，與目前已在NCBI文庫中發(fā)布的虹鱒[17]、非洲爪蟾[18]、 美洲狼鱸[19](MoroneAmericana)等卵生脊椎動物的極低密度脂蛋白受體(vldlr)結(jié)構(gòu)相似，表明該基因?qū)儆趘ldlr。此外，因使用SignalP軟件預(yù)測結(jié)果為分泌型信號肽，而且研究表明蛋白質(zhì)N端信號肽是指導(dǎo)分泌蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的決定因素，故推測該蛋白屬于分泌蛋白，且Smart軟件分析結(jié)果表明含有跨膜區(qū)域，說明該蛋白為表面受體蛋白。另外，從磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因含有豐富的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),對蛋白質(zhì)變構(gòu)和激活蛋白質(zhì)活力起到重要作用，而酪氨酸磷酸化位點(diǎn)除包含以上功能外，還可以結(jié)合蛋白，以促使與其他蛋白形成多蛋白復(fù)合體，從而發(fā)揮細(xì)胞信號傳導(dǎo)功能。

通過qRT-PCR對雙須骨舌魚不同組織和不同性腺發(fā)育時期vtgr的表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，在Ⅱ期卵巢中的vtgr表達(dá)量最高，隨后逐漸減低，這與Bujo等[20]、Prat等[21]、Hiramatsu等[19]對其他卵生動物所描述的類似。根據(jù)研究結(jié)果表明，雙須骨舌魚卵巢vtgr表達(dá)模式和卵巢發(fā)育階段緊密相關(guān)，vtgr在卵泡發(fā)生時在卵巢中高度表達(dá)，隨后在卵黃發(fā)生過程中表達(dá)量逐漸降低。根據(jù)劉紅等[9]對虹鱒卵巢進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)卵巢發(fā)育前期(I和Ⅱ期)vtgr的表達(dá)分布在卵母細(xì)胞膜上，細(xì)胞質(zhì)中含量較少，是因該基因的編碼蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)運(yùn)Vtg與傳遞信號等功能[21-23]。推測雙須骨舌魚vtgr轉(zhuǎn)錄主要發(fā)生在卵黃生成前，需要大量消耗vtgrmRNA，致使vtgr表達(dá)量升高。而在卵黃生成時，前期合成的Vtgr蛋白被連續(xù)循環(huán)地轉(zhuǎn)運(yùn)至卵膜發(fā)揮胞吞作用，使得Ⅲ和Ⅳ期中vtgr表達(dá)量顯著下降。在本實(shí)驗(yàn)室前期對雙須骨舌魚vtg相對表達(dá)量的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期卵巢中的相對表達(dá)量逐漸升高。這一結(jié)果與本次研究vtgr表達(dá)變化趨勢相反，其原因在于Vtg合成主要起始于Ⅲ期后，而Vtgr合成發(fā)生在Ⅱ期前為下一步卵母細(xì)胞吸收Vtg提前做準(zhǔn)備，以便為卵巢發(fā)育提供充足的營養(yǎng)。

本研究在雄魚的精巢內(nèi)也檢測到vtgr表達(dá)，且顯著高于其他組織，但3個時期表達(dá)量無顯著差異。與卵巢相比Ⅱ和Ⅲ期精巢表達(dá)量顯著低于卵巢，而Ⅳ期無顯著差異。由于目前研究以雌性魚類為主要研究對象，因此未能找相似結(jié)果。但根據(jù)前期對雙須骨舌魚vtg研究[24]發(fā)現(xiàn)，在雄魚的精巢中也檢測到vtg表達(dá)，推測Vtg是為精子發(fā)育提供營養(yǎng)與協(xié)助受精的作用。因此猜測精巢中Vtgr具有吸收Vtg為精子提供營養(yǎng)的功能，但該結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

雙須骨舌魚vtgr作為LDLR家族細(xì)胞表面受體的成員，其對細(xì)胞內(nèi)外的脂蛋白循環(huán)調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)Brow等[24]研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中LDLR是血漿中主要的膽固醇載脂蛋白，作用于調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的膽固醇平衡。而在魚類的vtgrcDNA中包含的8個LDLa結(jié)構(gòu)與哺乳動物VLDLRs高度相似[25]。目前已發(fā)現(xiàn)VLDLR可以作為中樞密度脂蛋白受體，在外周組織中具有獨(dú)特的配體特異性，與哺乳動物的脂蛋白脂肪酶具有相同作用[26]。已有研究表明在魚類的肝和脾中含有豐富的膽固醇，因此，觀察到雙須骨舌魚vtgr在肝和脾中有較高的表達(dá)，可能是轉(zhuǎn)運(yùn)組織中的膽固醇至血漿，通過血液循環(huán)到達(dá)魚體其他組織，從而達(dá)到維持機(jī)體膽固醇平衡的目的。

本研究目的在于探究vtgr在雌雄雙須骨舌魚組織中的表達(dá)特征，以及在性腺不同發(fā)育時期表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究Vtgr蛋白在性腺發(fā)育過程中的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也有助于我們對卵生魚類精子發(fā)育和卵母細(xì)胞生長的深入了解。