付立霞，高　雯，韓先干，高　波，張曉君，劉曉丹，曾令兵

(1.農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.江蘇省人畜共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241)

1　材料和方法

1.1　菌株、質(zhì)粒和試劑

1.2　引物設(shè)計(jì)與合成

1.3　質(zhì)粒和基因組的制備

表1　本研究中所用引物及其序列Tab.1　Primers and its sequences used in this study

注：質(zhì)粒pEI1中的CDS1(pEI1_CDS1)和pEI2中的CDS1(pEI2_CDS1)為非同源基因，為避免混淆，后續(xù)以orf1和orf2代替，以示區(qū)分。

1.4　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1質(zhì)粒pUC18-orf1的構(gòu)建

1.4.2質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的構(gòu)建

1.4.3質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2的構(gòu)建

在成功構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以引物orf2-F/orf2-R擴(kuò)增位于隱蔽質(zhì)粒pEI2上的預(yù)測(cè)編碼基因CDS1，最后通過上述方法將其克隆至質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1的KpnⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)之間，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pUC18-luxS-orf1-orf2 (圖1)，用于后續(xù)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

圖1　質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2的物理圖譜Fig.1　Physical map of plasmid pUC18-luxS-orf1-orf2

1.5　熒光定量PCR

熒光定量PCR在ABI 7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL， DNA模板8.8 μL，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s； 95 ℃變性5 s，60 ℃ 復(fù)性并延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。隨后進(jìn)行熔解曲線分析以確定引物的特異性，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，然后以0.1 ℃/s 的速率升溫至95 ℃， 進(jìn)而形成一個(gè)熒光信號(hào)隨溫度升高而減弱的熔解曲線圖。

1.6　質(zhì)?？截悢?shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的的建立

利用超微量分光光度計(jì)One Drop OD-1000+測(cè)定質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2濃度，根據(jù)下面公式[22]計(jì)算其對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)，然后10倍稀釋至108、107、106、105、104拷貝/μL，用作建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)模板。

反應(yīng)結(jié)束后，以測(cè)得Ct值為縱坐標(biāo)，拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，擴(kuò)增效率(E)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(k)相關(guān)[23]，計(jì)算公式為：

E=(10-1/k-1)×100%

1.7　質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算

同時(shí)采用絕對(duì)定量和相對(duì)定量的方法對(duì)質(zhì)粒拷貝數(shù)進(jìn)行計(jì)算，其中絕對(duì)定量參照Yu等[24]所述方法進(jìn)行。相對(duì)定量中質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算先按照Livak等[25]所述方法判斷-ΔΔCt方法對(duì)本研究數(shù)據(jù)處理的適用性，如不適用則參照Pfaffl等[26]所述方法進(jìn)行質(zhì)?？截悢?shù)的計(jì)算，公式為：

式中，Etarget為靶基因的擴(kuò)增效率；Erefere為參考基因的擴(kuò)增效率；ΔCt target(control-sample)為參照樣品中靶基因Ct減去待測(cè)試樣品中靶基因Ct；ΔCt referet(control-sample)為參照樣品中參考基因Ct減去待測(cè)試樣品中參考基因Ct。

1.8　Geneaid DNA Mini Kit對(duì)染色體DNA和質(zhì)粒DNA的回收率測(cè)定

1.9　統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，OriginPro 2016軟件對(duì)不同處理下得到的質(zhì)?？截悢?shù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為存在顯著性差異，P<0.01為存在極顯著性差異，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖2　目的基因的PCR擴(kuò)增Fig.2　PCR amplification of target genesM：DL2000 DNA Marker；1：orf1；2：luxS；3：orf2

對(duì)構(gòu)建成功的質(zhì)粒通過引物M13-47/ M13-48進(jìn)行PCR鑒定，可分別擴(kuò)增出大小約為811 bp，1 310 bp和1 753 bp的預(yù)期目的片段(圖3)，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2。

2.2　引物特異性評(píng)價(jià)

引物的特異性通過PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和熔解曲線進(jìn)行分析。電泳結(jié)果顯示，引物對(duì)qluxS-F/qluxS-R，qorf1-F/qorf1-R，qorf2-F/qorf2-R PCR對(duì)質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2和基因組總DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為91 bp，83 bp和130 bp預(yù)期大小的單一條帶(圖4)。熔解曲線亦顯示3對(duì)引物的PCR產(chǎn)物均表現(xiàn)為單一峰，這表明在分析溫度范圍內(nèi)，沒有非特異性擴(kuò)增。

圖3　構(gòu)建質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3　PCR identification for constructed plasmids M：DNA Marker DL-2000；1：pUC18-orf1；2：pUC18-luxS-orf1；3：pUC18-luxS-orf1-orf2

2.3　標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在1×104～1×108拷貝/μL濃度范圍內(nèi)，以測(cè)得Ct值對(duì)模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值作圖，結(jié)果見圖5，可見所有曲線均呈線性相關(guān)(R2>0.999)，斜率分別為-3.285 15、-3.333 5和-3.396、與之相應(yīng)的擴(kuò)增效率分別為101.6%、99.5%和 97.0%。熒光定量PCR要求R2>0.99，擴(kuò)增效率介于90%～110%之間。本研究中，基于3對(duì)引物進(jìn)行的熒光定量PCR均滿足條件，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。

圖4　熒光定量PCR產(chǎn)物電泳 Fig.4　Electrophoresis of real-time PCR products M：DL 2000 DNA Marker；1，3,5:以質(zhì)粒pUC18-luxS-orf1-orf2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的luxS，orf1和orf2 產(chǎn)物；2,4,6：以　愛德華氏菌總基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的luxS，orf1和orf2產(chǎn)物

圖5　luxS(a)、orf1(b)和orf2(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.5　Construction of the standard curves for luxS (a)，orf1 (b) and orf2 (c)

2.4　ΔΔCt方法的適用性評(píng)價(jià)

ΔΔCt方法計(jì)算有效的前提條件為，目的基因和參考基因的擴(kuò)增效率必須近似相等。為確認(rèn)這一點(diǎn)，以不同模板稀釋度下目的基因與參考基因Ct值的差值ΔCt對(duì)模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)進(jìn)行繪圖，如回歸斜率趨近于零即可確認(rèn)其有效性，而本研究中不同稀釋度下，目的基因orf1和orf2相對(duì)于參考基因luxS的ΔCt回歸斜率分別為-0.034 3(圖6a)和-0.145(圖6b)，這表明ΔΔCt方法適宜于前者而不宜用于后者的質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算。為保證計(jì)算的一致性，后續(xù)相對(duì)定量根據(jù)Pfaffl等[26]所述方法進(jìn)行。

圖6　ΔΔCt計(jì)算的有效性Fig.6　Validation of the ΔΔCt calculation for orf1/luxS (a) and orf2/luxS (b)

2.5　質(zhì)?？截悢?shù)計(jì)算

絕對(duì)定量策略下，試劑盒提取的總DNA中，pEI1的拷貝數(shù)為3.63±0.30，pEI2的拷貝數(shù)為5.04±0.18，而水煮法制備的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)則分別為11.84±0.80 和11.70±0.25 (表2)，兩種不同總DNA制備方法下所測(cè)得質(zhì)?？截悢?shù)差異極顯著。

表2　絕對(duì)定量測(cè)得的質(zhì)粒拷貝數(shù)Tab.2　Estimated plasmid copy number (PCN) by absolute quantification

注：同一列數(shù)據(jù)上標(biāo)中不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

相對(duì)定量策略下，試劑盒提取的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)分別為4.22±0.15和5.13±0.50，而水煮法制備的總DNA中，pEI1和pEI2的拷貝數(shù)則分別為13.85±1.64 和11.90±0.97(表3)，兩種不同總DNA制備方法下所測(cè)得質(zhì)粒拷貝數(shù)差異極顯著。

表3　相對(duì)定量測(cè)得的質(zhì)?？截悢?shù)Tab.3　Estimated plasmid copy number (PCN) by relative quantification

2.6　Geneaid DNA Mini Kit對(duì)染色體DNA和質(zhì)粒DNA的回收率

3　討論

在利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行質(zhì)?？截悢?shù)測(cè)定時(shí)，主要有兩種定量策略：絕對(duì)定量和相對(duì)定量，絕對(duì)定量需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此來(lái)推算未知樣本的量；而相對(duì)定量則只需確定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化即可，根據(jù)不同的計(jì)算方法又可分為2-ΔΔCt法和Pfaffl法等[25，26]，其中前者要求目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率基本相等且接近于100%，在實(shí)驗(yàn)中通常難以得到滿足，而后者則充分考慮了擴(kuò)增效率對(duì)結(jié)果的影響，更具有可行性，結(jié)果也更為準(zhǔn)確。在Lee等[27]對(duì)大腸桿菌質(zhì)粒拷貝數(shù)的測(cè)定中，基于2-ΔΔCt法的相對(duì)定量與絕對(duì)定量的計(jì)算結(jié)果基本一致。本研究中，由于針對(duì)luxS、orf1和orf2的引物擴(kuò)增效率不完全一致，分別為101.6%、99.5%、97.0%，最終采用Pfaffl法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算結(jié)果顯示，除水煮法組的pEI1拷貝數(shù)在兩種定量策略下存在差異之外(分別為11.84±0.80和13.85±1.64)，其余皆無(wú)顯著差異，這表明只要選擇合適的相對(duì)定量方法，其計(jì)算結(jié)果與絕對(duì)定量策略下的計(jì)算結(jié)果具有一致性。