華詔召　曾莉　曹俊巖

[摘要] 目的 探討子宮腔脫落細(xì)胞的DNA倍體分析技術(shù)應(yīng)用于子宮內(nèi)膜病變篩查的可行性及應(yīng)用價值。 方法 選取2014年1月～2016年5月就診于貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院疑似子宮內(nèi)膜病變患者500例為研究對象，采集子宮腔脫落細(xì)胞標(biāo)本，采用Feulgen染色和全自動DNA倍體分析系統(tǒng)分析患者DNA倍體情況，同時行分段診斷性刮宮術(shù)檢測，以分段診斷性刮宮術(shù)檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察DNA倍體分析對診斷子宮內(nèi)膜病變的敏感性和特異性。 結(jié)果 分段診斷性刮宮術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌39例（78.0%），癌前病變98例（19.6%），子宮內(nèi)膜量增生258例（51.6%），正常子宮內(nèi)膜105例（21.0%）。子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析子宮內(nèi)膜癌檢出率相似于病理檢查，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。以病理活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，DNA倍體分析篩查子宮內(nèi)膜病變的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度分別為92.7%、83.8%、86.2%，DNA倍體分析篩查子宮內(nèi)膜癌的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度分別為94.9%、67.7%、69.8%。 結(jié)論 DNA倍體分析對子宮內(nèi)膜癌的篩選敏感性高，可用于子宮內(nèi)膜病變的早期篩查，具有一定臨床推廣價值。

[關(guān)鍵詞] 子宮腔脫落細(xì)胞；DNA倍體分析；子宮內(nèi)膜病變；篩查

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0087-05

[Abstract] Objective To investigate the feasibility and application value of DNA quantitative analysis of uterine cavity exfoliated cells in screening endometrial lesions. Methods Five hundred patients with suspected endometrial lesions from January 2014 to May 2016 in the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College were selected as the research objects， specimens of uterine cavity exfoliated cells were collected， DNA ploidy was analyzed by Feulgen staining and automatic DNA quantitative analysis system， segmented diagnostic curettage was performed at the same time， the segmented diagnostic curettage results were the gold standard， the sensitivity and specificity of DNA quantitative analysis in diagnosis of endometrial lesions was observed. Results Segmental diagnostic curettage detection showed， 39 cases of endometrial carcinoma （78.0%）， 98 cases of precancerous lesion （19.6%）， 258 cases of endometrial hyperplasia （51.6%）， 105 cases of normal endometrium （21.0%）. The detection rate of endometrial carcinoma of DNA ploidy analysis of uterine cavity exfoliated cells was similar to pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. DNA ploidy analysis of exfoliated uterine cavity precancerous lesions were similar to the pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. With the pathological biopsy results as the gold standard， the sensitivity， specificity and accuracy of endometrial lesions DNA quantitative analysis were 92.7%， 83.8% and 86.2% respectively. The sensitivity， specificity and accuracy of DNA quantitative analysis in screening endometrial cancer were 94.9%， 67.7% and 69.8% respectively. Conclusion DNA quantitative analysis of endometrial cancer has high screening sensitivity， can be used for early screening of endometrial lesions， has a certain clinical value.

[Key words] Uterine cavity exfoliated cells； Image cytometry DNA ploidy； DNA quantitative analysis； Endometrial lesions； Screening

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，其死亡率居女性惡性腫瘤第二位，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。目前子宮內(nèi)膜癌的診斷主要借助診刮術(shù)進(jìn)行組織學(xué)檢查，但其操作復(fù)雜，費用高，且存在病情長期監(jiān)控難、患者依從性差等問題[2]，因此亟需尋找一種質(zhì)優(yōu)價廉、安全無痛、簡便易行、準(zhǔn)確性高的子宮內(nèi)膜病變篩查方法。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）倍體分析技術(shù)通過定量檢測細(xì)胞核內(nèi)染色體數(shù)目，并以此為依據(jù)判斷細(xì)胞的良惡性傾向[3]。在癌變和癌前病變細(xì)胞中，染色體常常發(fā)生非整倍體化，可作為診斷癌及癌前病變的特異性指征[4]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)可有效提高尿路上皮脫落細(xì)胞診斷尿路上皮癌的靈敏度和準(zhǔn)確性[5]。陶偉等[6]應(yīng)用DNA定量分析技術(shù)診斷肺癌的敏感度為69.2%，特異度為100.0%，與液基細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合能顯著提高肺癌的陽性檢出率。本課題旨在探討子宮腔脫落細(xì)胞的DNA倍體分析應(yīng)用于子宮內(nèi)膜病變篩查中的可行性及應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2016年5月就診于貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）疑似子宮內(nèi)膜病變患者500例為研究對象，年齡30～79歲，平均（59.63±10.31）歲；絕經(jīng)后患者392例。其中不明原因陰道流血者389例（389/500，77.80%），圍經(jīng)期陰道異常排液者27例（27/500，5.40%）；絕經(jīng)后陰道異常排液者11例（11/500，2.20%）；絕經(jīng)后無臨床癥狀但經(jīng)B超顯示宮腔內(nèi)有不均質(zhì)占位或子宮內(nèi)膜厚度超過5 mm者（73/500，14.60%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①出現(xiàn)不明原因陰道異常出血或排液患者；②明確本研究內(nèi)容并同意簽署知情同意書患者；③有3年及以上性生活史患者；④臨床資料完整患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮頸病變引起陰道流血患者；②卵巢病變引起陰道流血患者；③陰道炎等病變引起陰道流血患者；④妊娠期婦女；⑤其他惡性腫瘤或嚴(yán)重全身性疾病患者；⑥中途退出刮宮術(shù)檢測患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存 DNA倍體分析樣品 于就診當(dāng)日檢查并明確各受試者子宮位置和深度，采用SAP-I子宮內(nèi)膜細(xì)胞采集器（北京賽普九洲科技公司）進(jìn)入宮腔采集子宮腔脫落細(xì)胞，立即置于宮腔細(xì)胞保存液（北京賽普九洲科技公司）中，核對患者信息后貼好標(biāo)簽，送至病理科檢驗DNA。病理檢測樣品：采集各受試者子宮腔脫落細(xì)胞的同時，行宮腔鏡診刮術(shù)采集患者宮頸管、宮腔組織標(biāo)本，置于甲醛中固定，貼好標(biāo)簽，送至病理科檢查。

1.2.2 組織病理學(xué)檢查 每位患者的子宮內(nèi)膜組織切片經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，經(jīng)2位資深病理師閱片分析，按照2003年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定性檢測[7]，分為以下4類：①未見子宮內(nèi)膜病變，包括增生期子宮內(nèi)膜、萎縮性子宮內(nèi)膜、分泌期子宮內(nèi)膜；②良性子宮內(nèi)膜病變，包括子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉、黏膜下肌瘤等；③不典型型子宮內(nèi)膜增生，即癌前病變；④子宮內(nèi)膜癌。以此診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行對照診斷研究。

1.2.3 DNA定量分析檢測 將“1.2.1”中子宮腔脫落細(xì)胞懸液離心5 min，800 r/min，棄上清，重新懸浮下層細(xì)胞后，制備細(xì)胞薄片，采用福爾根（Feulgen）染色法進(jìn)行染色、封片。采用Motic BA600-4全自動掃描顯微鏡（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)公司）對薄片進(jìn)行掃描和檢測，以薄片中正常細(xì)胞作為參照，系統(tǒng)根據(jù)收集到的細(xì)胞核染色體分布、形態(tài)特征、局部特定特征等參數(shù)自動對受檢細(xì)胞進(jìn)行分類和計數(shù)。其中DNA指數(shù)（DNA index，DI）可用來表示細(xì)胞中DNA含量：0.75≤DI<1.25，為DNA含量為2c的正常細(xì)胞；1.25≤DI≤2.50，為DNA含量為2c～5c的疑似病變細(xì)胞或增生細(xì)胞；DI>2.50，為DNA含量多于5c的病變細(xì)胞。參考DNA倍體分析對子宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，進(jìn)行分析，結(jié)果如下：①陰性病例：薄片內(nèi)以正常細(xì)胞為主，未觀察到DI>2.50的病變細(xì)胞，且增生細(xì)胞比例低于5%；②可疑病例：觀察到1或2個DI>2.50的病變細(xì)胞或增生細(xì)胞比例在5%～10%之間；③陽性病例：觀察到3個或以上的病變細(xì)胞，或增生細(xì)胞比例>10%，其中分析結(jié)果為①和②的病例，均規(guī)定為DNA異倍體真陰性；③為DNA異倍體真陽性。所有DI>2.50的病變細(xì)胞均經(jīng)資深病理師復(fù)核確認(rèn)，以保證DNA定量分析檢測的準(zhǔn)確性。

1.2.4 敏感性、特異性、準(zhǔn)確度分析 以病理活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，以檢測出子宮內(nèi)膜病變?yōu)樵\斷陽性，計算出DNA倍體分析篩選子宮內(nèi)膜病變的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度，敏感性=真陽性/病例組例數(shù)，特異性=真陰性/對照組例數(shù)，準(zhǔn)確度=（真陰性+真陽性）/（對照組例數(shù)+病例組例數(shù)）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)

正常子宮內(nèi)膜組織子宮內(nèi)膜形態(tài)規(guī)則（圖1 A），異常增生子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)不規(guī)則（圖1 B），子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)膜形態(tài)極度不規(guī)則，出現(xiàn)大量腔隙（圖1 C）。

2.2 子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析結(jié)果

DNA倍體分析發(fā)現(xiàn)陰性病例子宮內(nèi)膜組織中以DNA含量為2c的正常細(xì)胞為主，未見病變細(xì)胞，且增生細(xì)胞比例低于5%（圖2A）；可疑病例子宮內(nèi)膜組織中出現(xiàn)大量DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細(xì)胞或增生細(xì)胞，少見DNA含量≥5c的病變細(xì)胞（圖2B）；陽性病例子宮內(nèi)膜組織中多為DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細(xì)胞或增生細(xì)胞，DNA含量≥5c的病變細(xì)胞增多（圖2C）。

2.3 病理學(xué)檢測結(jié)果與子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析檢測結(jié)果的比較

子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析子宮內(nèi)膜癌檢出率相似于病理檢查，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析子宮內(nèi)膜良性增生檢出率低于病理檢查，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析正常子宮內(nèi)膜檢出率低于病理檢查，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.4 子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析篩查子宮內(nèi)膜病變及子宮內(nèi)膜癌的診斷效率

以病理活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，DNA倍體分析篩查子宮內(nèi)膜病變的結(jié)果見表2。以病理檢查結(jié)果為癌前病變和子宮內(nèi)膜癌作為子宮病變篩查陽性的標(biāo)準(zhǔn)，DNA倍體分析子宮內(nèi)膜病變篩查的敏感性為92.7%，特異性為83.8%，準(zhǔn)確度為86.2%。以病理檢查結(jié)果子宮內(nèi)膜癌作為子宮內(nèi)膜癌篩查陽性的標(biāo)準(zhǔn)，DNA倍體分析子宮內(nèi)膜病變篩查的敏感性為94.9%，特異性為67.7%，準(zhǔn)確度為69.8%。見表3。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于女性生殖器最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病呈年輕化趨勢[9]。目前對子宮內(nèi)膜癌的診治技術(shù)雖然已取得一定完善與進(jìn)步，但子宮內(nèi)膜癌仍然嚴(yán)重威脅女性的生命健康。早期患者預(yù)后好，晚期患者治療效果差，Ⅳ期患者存活率為5%～15%[10]，由此可見，提高子宮內(nèi)膜癌早期診斷的精確性對改善患者預(yù)后十分重要。因此，必須對子宮內(nèi)膜病變的早期篩查給予高度重視。

惡性腫瘤的發(fā)生源于組織細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變，癌變細(xì)胞中DNA倍體多出現(xiàn)異常，染色體數(shù)目增多，產(chǎn)生異倍體細(xì)胞[11-12]。DNA的異常變化常早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，因此測定DNA含量以預(yù)測腫瘤的發(fā)生可能優(yōu)于觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。Xu等[13]發(fā)現(xiàn)，腫瘤較大、分化較高的晚期乳腺癌患者乳腺細(xì)胞發(fā)生DNA異倍體化的可能性更大，異倍體患者的臨床療效明顯弱于二倍體患者。Nishimura等[14]研究表明，胃癌組織中USP44高表達(dá)與DNADNA異倍化密切相關(guān)，與非整倍體胃癌患者無進(jìn)展生存期和總體生存期密切相關(guān)。Mauland等[15]發(fā)現(xiàn)，DNA異倍化與子宮內(nèi)膜癌患者年齡、FIGO分期和分級、ER/PR陰性以及生存率明顯相關(guān)，DNA異倍體化是ER/PR陰性子宮內(nèi)膜癌患者低生存率、高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率的危險預(yù)測因子。本研究發(fā)現(xiàn)，正常子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞內(nèi)DNA含量為2c，異常子宮內(nèi)膜組織中出現(xiàn)DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細(xì)胞或增生細(xì)胞，并可見少量DNA含量>5c的病變細(xì)胞，癌變子宮內(nèi)膜組織中多為DNA含量為2.5c～5c的細(xì)胞，且DNA含量>5c的細(xì)胞增多。提示細(xì)胞內(nèi)DNA倍體的改變與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

細(xì)胞DNA倍體分析可在組織細(xì)胞未發(fā)生明顯形態(tài)學(xué)改變前檢測出病變細(xì)胞，實現(xiàn)早期診斷。Dayal等[16]發(fā)現(xiàn)，DNA定量分析可增加p53、HER2等對乳腺癌的預(yù)測價值，與患者預(yù)后有關(guān)。Fadhil等[17]發(fā)現(xiàn)DNA定量分析可有效預(yù)測結(jié)直腸癌的發(fā)生。甘密密等[18]發(fā)現(xiàn)DNA異倍體細(xì)胞數(shù)目與宮頸病變程度正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在確診子宮內(nèi)膜癌病例中，37例為DNA異倍體陽性，癌前病變中，90例為DNA異倍體陽性，子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，其篩查子宮內(nèi)膜病變的敏感性為92.7%，特異性為83.8%，準(zhǔn)確度為86.2%，與楊寶華等[19]應(yīng)用DNA定量分析技術(shù)篩查子宮內(nèi)膜病變的結(jié)果基本一致。表明DNA定量倍體分析具有可重復(fù)性和客觀性，可應(yīng)用于子宮內(nèi)膜病變的篩選。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析子宮內(nèi)膜癌檢出率相似于病理檢查，其篩查子宮內(nèi)膜癌的敏感性高達(dá)94.9%，特異性和準(zhǔn)確度分別為67.7%和69.8%。提示DNA倍體分析可有效篩查出子宮內(nèi)膜癌高危患者，從而有針對性地進(jìn)行組織活檢。

本研究中有2例子宮內(nèi)膜癌患者未檢測出DNA異倍體陽性，回顧性分析患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，漏診患者均表現(xiàn)出絕經(jīng)期陰道不規(guī)則出血癥狀，由于子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展是一個由子宮內(nèi)膜良性增生到不規(guī)則增生再到癌變的連續(xù)惡化過程[20]，任意階段病變均可能導(dǎo)致陰道不規(guī)則流血的發(fā)生。另外，有時腫瘤的發(fā)生不涉及DNA倍體的變化，推測漏診患者可能是二倍體腫瘤。而DNA倍體分析只能檢測出DNA倍體發(fā)生變化的腫瘤患者，無法檢測出二倍體腫瘤患者，因此，對可疑病例須結(jié)合診斷性刮宮術(shù)進(jìn)行組織病理學(xué)檢測，以提高DNA倍體分析篩選子宮內(nèi)膜癌的準(zhǔn)確性。

綜上所述，子宮腔脫落細(xì)胞DNA倍體分析技術(shù)安全易行，敏感性高，且具有可重復(fù)性，可應(yīng)用于子宮內(nèi)膜病變尤其是子宮內(nèi)膜癌的篩查，具有重要的應(yīng)用價值。但本研究所選病例局限于貴州地區(qū)，且數(shù)據(jù)量較小，尚需要擴(kuò)大研究范圍，增加病例數(shù)目進(jìn)一步驗證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lheureux S，Wilson M，Mackay HJ. Recent and current Phase II clinical trials in endometrial cancer：review of the state of art [J]. Expert Opin Inv Drug，2014，23（6）：773-792.

[2] 江梅珍，金海燕，何鳳儀，等.宮腔鏡下分段診斷性刮宮術(shù)在子宮內(nèi)膜癌術(shù)前診斷的價值探討[J].中國實用醫(yī)藥，2014，22（1）：34-36.

[3] Carter SL，Cibulskis K，Helman E，et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer [J]. Nat Biotechnol，2012，30（5）：413-421.

[4] Garner D. Clinical application of DNA ploidy to cervical cancer screening：a review [J]. J Clin Oncol，2014，5（5）：931-965.

[5] 蘇杰，陶偉，張培，等.細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)在尿路上皮癌診斷中的應(yīng)用價值[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（5）：750-753.

[6] 陶偉，李俊，程柳柳.細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)在肺癌診斷中的應(yīng)用價值[J].中華腫瘤雜志，2016，38（2）：113-117.

[7] Walker RA. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs [J]. Histopathology，2005，46（2）：229-229.

[8] 孫小蓉，汪健.DNA定量細(xì)胞學(xué)[M].武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2011：85-90.

[9] 楊曦，馬珂，吳成.子宮內(nèi)膜癌的流行病學(xué)及高危因素[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（7）：485-488.

[10] Eltabbakh GH，Shamonki MI，Moody JM，et al. Laparoscopy as the primary modality for the treatment of women with endometrial carcinoma [J]. Cancer，2015，91（2）：378-387.

[11] Potapova TA，Zhu J，Li R. Aneuploidy and chromosomal instability：a vicious cycle driving cellular evolution and cancer genome chaos [J]. Cancer Metast Rev，2013，32（1）：1007-1021.

[12] Holland AJ，Cleveland DW. Losing balance：the origin and impact of aneuploidy in cancer [J]. EMBO Reports，2012， 13（6）：501-514.

[13] Xu J，Huang L，Li J. DNA aneuploidy and breast cancer： a meta-analysis of 141，163 cases [J]. Oncotarget，2016， 7（37）：60 218-60 229.

[14] Nishimura S，Oki E，Ando K，et al. High ubiquitin-specific protease 44 expression induces DNA aneuploidy and provides independent prognostic information in gastric cancer [J]. Cancer Med，2017，6（6）：1453-1464.

[15] Mauland KK，Wik E，Hoivik EA，et al. Aneuploidy related transcriptional changes in endometrial cancer link low expression of chromosome 15q genes to poor survival [J]. Oncotarget，2017，8（6）：9696-9707.

[16] Dayal JHS，Sales MJ，Corver WE，et al. Multiparameter DNA content analysis identifies distinct groups in primary breast cancer [J]. Brit J Cancer，2013，108（4）：873-880.

[17] Fadhil W，Kindle K，Jackson D，et al. DNA content analysis of colorectal cancer defines a distinct “microsatellite and chromosome stable” group but does not predict response to radiotherapy [J]. Int J Exp Pathol，2014，95（1）：16-23.

[18] 甘密密，張錫流.DNA定量分析及TCT技術(shù)診斷宮頸病變的臨床研究[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2014，30（9）：674-677.

[19] 楊寶華，徐軍，蘇燕，等.子宮內(nèi)膜細(xì)胞DNA定量分析對子宮內(nèi)膜癌的篩查價值[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2017，38（3）：60-65.

[20] 梁海燕，凌斌.圍絕經(jīng)期子宮內(nèi)膜病變所致陰道流血[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2012，28（10）：724-728.

（收稿日期：2017-12-12 本文編輯：任 念）