許寧寧

（張家口市第一醫(yī)院，張家口　075000）

慢性腎功能衰竭（CRF）是多種慢性腎臟疾病導致腎功能減退，引發(fā)腎小球濾過率下降、毒素潴留、電解質(zhì)代謝紊亂、酸堿失衡等，呈現(xiàn)全身多系統(tǒng)癥狀的一個臨床綜合征[1-2]，是各種腎臟疾病終末期的共同結(jié)局。既往研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)及腎臟組織纖維化是導致腎結(jié)構(gòu)破壞、功能減退甚至喪失的主要病理原因，是各種慢性腎病發(fā)展為CRF的共同通路[3]，因此抑制腎纖維化是延緩腎功能衰竭的有效途徑，也是新藥研發(fā)的重要思路。大蒜素是一種具有降血脂、改善血流動力學等藥理學作用的二烯丙基三硫化物[4-5]，且葉靜等[6]和曾玉蘭等[7]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對肝組織纖維化和肺組織纖維化均具有一定的抑制作用，朱蘭香等[8]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對肝組織纖維化后炎癥研發(fā)具有抑制作用，但大蒜素對CRF后炎癥反應(yīng)和腎臟組織纖維化的影響相關(guān)文獻報道尚不多見。本研究通過制備CRF大鼠模型，觀察大蒜素對CRF大鼠炎癥反應(yīng)和腎臟組織纖維化的影響，探討大蒜素對CRF大鼠的保護作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性清潔級SD大鼠，7周齡，200～240 g，河北省實驗動物中心提供[SCXK（冀）：2013-1-003]。

1.2實驗藥物與試劑大蒜素注射液[黑龍江江世藥業(yè)有限公司，2 mL（30 mg）]；H&E 試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、尿酸（UA）、尿蛋白（Pro）試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；C-Ⅳ、PC-Ⅲ、層黏連蛋白（LN）、纖維連接蛋白（FN）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（北京博奧森生物工程有限公司）；I型膠原（Col I）、纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）多克隆抗體SP試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；腺嘌呤（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3模型制備與分組參照文獻方法制備CRF大鼠模型[9]：25%腺嘌呤溶液250 mg/（kg·d）連續(xù)灌胃21 d制備CRF大鼠模型，正常對照組正常飲食與飲水。80只模型大鼠隨機分為模型組和大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）組，每組20只，另設(shè)正常對照組（20只）。取大蒜素注射液并加適量生理鹽水配置濃度為10、5、2.5 mg/mL大蒜素溶液，各組大鼠分別給藥2 mL/kg，模型組和正常對照組分別給予等體積生理鹽水2 mL/kg，療程為28 d。

1.4實驗方法

1.4.1血清指標檢測腹腔注射10%水合氯醛實施麻醉，開腹并經(jīng)腹主動脈取血（不抗凝），離心取血清，分別按照試劑盒使用說明進行處理，然后通過生化分析儀測定血清 BUN、SCr、UA、Pro含量；參照各指標酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測血漿中CⅣ、PCⅢ、LN、HN水平；參照各指標ELISA檢測試劑盒操作說明，通過酶標儀檢測血清中CRP、IL-6、TNF-α含量水平。

1.4.2腎臟指數(shù)計算治療完成后分別稱鼠體質(zhì)量，取雙側(cè)腎臟組織并稱左側(cè)腎質(zhì)量，然后計算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)=左側(cè)腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4.3腎臟組織病變觀察及病變評分取右側(cè)腎臟組織，置于多聚甲醛溶液（濃度為4%）中固定72 h，依次進行石蠟包埋、切片（3 μm）和常規(guī)脫蠟水化處理，按照HE染色試劑盒說明進行處理，封片后通過顯微鏡觀察腎臟組織病變并照相保存。腎臟組織病變評分：標準見表1。

表1　腎臟組織病變評分標準Tab.1　Criteria for classification of renal tissue lesions

1.4.4腎臟中Col I、PAI-1、MMP-1表達的測定取“1.4.3”制備的腎臟組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化處理后，采用SP法行免疫組織化學染色（IHC）觀察Col I、PAI-1、MMP-1表達。染色圖片均采用Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)進行分析，分別選取5個不同的視野測定光密度值（OD），以O(shè)D表示Col I、PAI-1、MMP-1表達。

1.5統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)運用SPSS 19.0進行數(shù)理統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，計量資料若呈正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析；計量資料若呈偏態(tài)分布，組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1血清腎功能指標檢測結(jié)果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量均升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清BUN、SCr、UA及尿液Pro含量（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果見表 2。

表2　各組大鼠血清腎功能及尿液Pro指標檢測結(jié)果（x±s）Tab.2　The results of serum renal function in rats of each group（±s）

表2　各組大鼠血清腎功能及尿液Pro指標檢測結(jié)果（x±s）Tab.2　The results of serum renal function in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數(shù)BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）正常對照組　20　6.09±1.41　70.05±9.17模型組　20　24.07±3.82**　134.89±35.02**大蒜素5 mg/（kg·d）組2019.97±4.09125.90±36.82大蒜素10 mg/（kg·d）組2014.51±2.76##116.28±27.35#大蒜素20 mg/（kg·d）組2011.48±2.43##106.57±24.18#組別　動物數(shù)　UA（mmol/L）　Pro（mg/24 h）正常對照組　20　65.94±9.82　75.88±21.80模型組　20　114.76±16.53**　177.94±96.47**大蒜素5 mg/（kg·d）組2098.56±23.08169.81±98.85大蒜素10 mg/（kg·d）組2083.34±16.42##152.79±48.43#大蒜素20 mg/（kg·d）組2077.86±13.97##137.03±42.61##

2.2腎臟指數(shù)計算結(jié)果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低且腎臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著提高CRF大鼠體質(zhì)量并降低腎臟指數(shù)（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表 3。

表3　各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)計算結(jié)果（±s）Tab.3　The body weight and kidney index in rats of each group（±s）

表3　各組大鼠體質(zhì)量、腎臟指數(shù)計算結(jié)果（±s）Tab.3　The body weight and kidney index in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數(shù)　體質(zhì)量（g）　腎臟指數(shù)（×10-3）正常對照組　20　311.27±33.53　3.82±0.61模型組　20　208.67±31.59**　17.03±2.05**大蒜素5 mg/（kg·d）組20216.04±28.5215.85±1.91大蒜素10 mg/（kg·d）組20226.53±28.18#13.23±1.63##大蒜素20 mg/（kg·d）組20241.60±31.24#10.62±1.19##

2.3腎臟組織病變的觀察結(jié)果及病變評分的測定結(jié)果正常對照組大鼠腎小球、腎小管、間質(zhì)區(qū)組織均未見異常，未見腎臟組織炎癥病變和纖維化病變；CRF模型組呈現(xiàn)腎小球增大變性、球囊粘連、囊腔和管腔擴大，腎小管內(nèi)結(jié)晶、壞死處可見大量炎癥細胞和少量中性粒細胞浸潤,間質(zhì)纖維組織大量增生，呈慢性進行性腎臟纖維化改變；大蒜素5、10、20 mg/（kg·d）組能夠不同程度改善CRF大鼠腎臟組織炎癥病變和纖維化病變，以20 mg/（kg·d）組最為顯著，結(jié)果見圖1。CRF模型組大鼠腎臟組織病變評分顯著升高（P＜0.01），大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠病變評分（P＜0.01），結(jié)果見表4。

表4　各組大鼠腎臟組織病變評分（x±s）Tab.4　The scores of renal tissue lesions in rats of each group（±s）　分

表4　各組大鼠腎臟組織病變評分（x±s）Tab.4　The scores of renal tissue lesions in rats of each group（±s）　分

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別　動物數(shù)　病變評分正常對照組　20　0.69±0.25模型組　20　9.43±0.58**大蒜素 5 mg/kg·d 組　20　8.14±0.76大蒜素 10 mg/kg·d 組　20　6.82±0.66##大蒜素 20 mg/kg·d 組　20　6.22±0.59##

2.4血清中C-IV、PC-Ⅲ、LN、FN水平測定結(jié)果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠血清中C-IV、PC-III、LN含量水平顯著升高且FN水平顯著降低（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清C-IV、PC-Ⅲ、LN水平并提高FN 水平（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果見表 5。

表 5　各組大鼠血清中 C-IV、PC-III、LN、FN 水平（±s）Tab.5　The levels of C-IV,PC-III,LN and FN in serum of rats of each group（±s）

表 5　各組大鼠血清中 C-IV、PC-III、LN、FN 水平（±s）Tab.5　The levels of C-IV,PC-III,LN and FN in serum of rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動物數(shù)C-I V（n g/m L）P C-I I I（n g/m L）正常對照組　2 0　1 2.8 7±2.6 1　1 9.8 9±4.5 6模型組　2 0　6 7.5 3±8.3 9**　5 4.2 0±7.0 8**大蒜素5 m g/（k g·d）組2 0 5 9.1 8±9.1 7 4 7.5 4±7.9 4大蒜素1 0 m g/（k g·d）組2 0 4 0.2 6±7.1 2#3 2.0 3±5.8 9#大蒜素2 0 m g/（k g·d）組2 0 2 3.7 9±4.2 5##2 4.3 1±5.8 4##組別　動物數(shù)　L N（n g/m L）　F N（m g/L）正常對照組　2 0　2 5.0 8±1 1.0 2　1 4 7.6 1±3 3.8 5模型組　2 0　1 1 7.8 3±3 5.7 6**　6 6.7 2±1 3.0 9**大蒜素5 m g/（k g·d）組2 0 1 0 7.5 8±4 0.8 1 7 9.5 6±1 8.6 2大蒜素1 0 m g/（k g·d）組2 0 9 9.0 5±3 8.1 7 9 8.5 8±2 1.4 3#大蒜素2 0 m g/（k g·d）組2 0 8 3.4 2±2 8.8 3#1 2 5.9 6±2 5.1 2##

2.5血清中炎癥因子含量測定結(jié)果CRF模型組大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著降低CRF大鼠血清 CRP、TNF-α 含量（P＜0.05或 P＜0.01），其中20 mg/（kg·d）組能夠降低IL-6含量（P＜0.05）。結(jié)果見表6。

表6　各組大鼠血清中炎癥因子含量（±s）Tab.6　The levels of inflammatory factors in serum of rats of each group（±s）

表6　各組大鼠血清中炎癥因子含量（±s）Tab.6　The levels of inflammatory factors in serum of rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數(shù) CRP（mg/L） IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常對照組　20　5.30±1.07　40.83±2.19　71.90±3.52模型組　20　11.64±1.95**94.70±5.05**255.87±31.93**大蒜素5 mg/（kg·d）組2010.73±2.3090.06±6.28225.86±30.07大蒜素10 mg/（kg·d）組208.79±1.84#84.84±5.81184.37±24.15##大蒜素20 mg/（kg·d）組207.51±1.69##78.26±5.59#126.82±12.96##

2.6腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達測定結(jié)果與正常對照組比較，CRF模型組大鼠腎臟組織Col I、PAI-1表達顯著上調(diào)而MMP-1表達顯著下調(diào)（P＜0.01）；大蒜素10、20 mg/（kg·d）組能夠顯著下調(diào)Col I、PAI-1 表達并上調(diào) MMP-1（P＜0.05 或 P＜0.01）。結(jié)果見表7和圖2-4。

表7　各組大鼠腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達OD 值（±s）Tab.7　The OD of the expression Col I,PAI-1 and MMP-1 in the kidney tissues in rats of each group（±s）

表7　各組大鼠腎臟組織中Col I、PAI-1、MMP-1表達OD 值（±s）Tab.7　The OD of the expression Col I,PAI-1 and MMP-1 in the kidney tissues in rats of each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　動物數(shù)　Col I　PAI-1　MMP-1正常對照組　20　0.04±0.02　0.06±0.02　0.29±0.06模型組　20　0.27±0.05**0.31±0.08**0.04±0.02**大蒜素5 mg/（kg·d）組200.25±0.060.24±0.070.06±0.02大蒜素10 mg/（kg·d）組200.17±0.03#0.20±0.05#0.10±0.03#大蒜素20 mg/（kg·d）組200.09±0.03##0.16±0.04#0.22±0.05##

圖1　各組大鼠腎臟組織病變（HE，×200）Fig.1　The renal tissue lesions in rats of each group(HE,×200)

圖2　各組大鼠腎臟組織Col I表達（IHC，×400）Fig.2　The expression of Col I in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

圖3　各組大鼠腎臟組織PAI-1表達（IHC，×400）Fig.3　The expression of PAI-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

圖4　各組大鼠腎臟組織MMP-1表達（IHC，×400）Fig.4　The expression of MMP-1 in renal tissue in rats of each group（IHC,×400）

3　討論

本實驗通過腺嘌呤溶液250mg/（kg·d）灌胃21d的方法建立CRF動物模型[10]，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)大蒜素治療28 d能夠有效降低CRF大鼠血清 BUN、SCr、UA、24 h尿蛋白含量，抑制CRF大鼠腎臟組織病變，提高體質(zhì)量并降低腎臟指數(shù)，提示大蒜素具有改善CRF大鼠腎功能、對其腎臟組織具有一定的保護作用。

腎臟組織纖維化是各種腎臟慢性疾病逐漸發(fā)展為CRF的共同病理通路，因此阻滯其纖維化是延緩CRF的必要途徑。Col I是腎組織間質(zhì)中存在的主要膠原成分，Col I大量積聚是腎組織纖維化的重要原因[11]。正常生理狀態(tài)下，Col I生成與降解處于動態(tài)平衡，基質(zhì)金屬蛋白酶系（MMPs）和絲氨酸蛋白酶系（PAIs）是機體Col I表達的主要調(diào)控酶。MMPs系統(tǒng)中MMP-1和PAIs系統(tǒng)中的PAI-1對Col I及腎臟組織細胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解起主要調(diào)控作用[12-13]。其中PAI-1具有抑制纖溶酶原激活物活化而抑制MMP-1活性的作用，因此在MMP-1、PAI-1構(gòu)成的 Col I降解調(diào)控系統(tǒng)中，MMP-1是降解Col I的主要調(diào)控酶，而PAI-1主要是通過調(diào)節(jié)MMP-1活性而間接調(diào)控Col I的降解[11]。C-IV、LN、FN是構(gòu)成ECM的主要成分，Border WA等[14]研究發(fā)現(xiàn)血清C-IV、LN含量升高及FN降低是慢性腎衰病變的重要臨床指征。PC-Ⅲ是一種間質(zhì)膠原，廣泛存在于腎組織中，其聚集升高是促進腎臟組織纖維化和腎小球硬化的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d能夠有效降低CRF大鼠血清C-IV、LN、PC-Ⅲ含量并升高FN含量；通過IHC觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d能夠有效下調(diào)CRF大鼠腎臟組織Col I蛋白表達并下調(diào)PAI-1表達、上調(diào)MMP-1表達，提示大蒜素調(diào)節(jié)MMPs、PAIs調(diào)控系統(tǒng)并調(diào)節(jié)血清C-IV、LN、PC-Ⅲ、FN含量而具有抑制CRF大鼠腎臟組織纖維化的作用。

腎臟組織纖維化病理機制非常復雜，楊婧等[15]研究發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤在腎臟組織纖維化病變過程中發(fā)揮著重要作用。血清炎癥細胞因子（CRP、IL-6、TNF-α）含量水平是臨床監(jiān)測機體炎癥反應(yīng)的常用指標[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療28 d能夠有效降低 CRF大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量水平，進而起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，大蒜素可能通過抑制炎癥反應(yīng)和腎臟組織纖維化而對CRF大鼠起到一定的保護作用，機制可能與大蒜素調(diào)節(jié)MMPs、PAIs調(diào)控系統(tǒng)并調(diào)節(jié)血清C-IV、LN、PC-III、FN含量，以及抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。