雷洋洋，楊　波，裴　明，林　燕，楊洪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津　300193）

腹膜纖維化作為長程腹膜透析常見并發(fā)癥，可導(dǎo)致腹膜超濾與轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭，腹膜結(jié)構(gòu)、功能喪失。因此有必要探尋能夠干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)腹膜纖維化進(jìn)程的分子機(jī)制，間充質(zhì)間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腹膜纖維化起始和可逆環(huán)節(jié)，有效調(diào)控EMT可抑制甚至逆轉(zhuǎn)早期腹膜纖維化，本課題擬采用天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科之扶腎方以中醫(yī)學(xué)“和法”理論為宗，探討扶腎方對尿毒癥大鼠腹膜間充質(zhì)EMT影響，為中醫(yī)治療腹透腹膜纖維化提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g，鼠齡6～8周，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器扶腎方中藥飲片（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）；肌酐生化試劑盒與尿素氮試劑盒（南京建成科技有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）（北京中杉金橋生物科技有限公司）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）；微量移液器（美國Eppendorf公司）；低溫高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；-20℃/4℃冰箱（青島海爾）。

1.3分組與給藥50只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組10只，每日給予扶腎方中藥灌胃，實(shí)驗(yàn)周期為6周，具體見表1。

1.4尿毒癥模型鑒定50只雄性SD實(shí)驗(yàn)大鼠在處死之前，目內(nèi)眥取血，3 000 r/min離心15 min后，取上清，檢測血清肌酐值和血清尿素氮值。

1.5扶腎方含藥血清的制備方法采用清潔級(jí)雄性SD大鼠，按照人的臨床劑量折算大鼠的灌胃量，每組連續(xù)灌胃7 d，在最后1次灌胃后2 h，取血分離含藥血清，同時(shí)取正常組大鼠血，0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，56℃，30 min滅活補(bǔ)體，制成含藥血清冰箱保存?zhèn)溆茫?20℃含藥血清有效成分的濃度及有效成分由南開大學(xué)高分子化學(xué)研究所采用高效液相色譜法測定。

表1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥情況Tab.1　Grouping and administration of experimental animals

1.6檢測指標(biāo)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法檢測 E-鈣黏素（E-cadherin）和 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），提取組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR的總反應(yīng)體系為20 uL，將樣品放入PCR儀，設(shè)定反應(yīng)參數(shù)后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集，引物序列見表2；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測TGF-β1含量的變化；采用堿性苦味酸比色法測定大鼠血清肌酐、尿素氮含量。

表2　E-cadherin、α-SMA基因引物Tab.2　E-cadherin、α-SMA primer

1.7光鏡下腹膜組織形態(tài)變化取大鼠壁層腹膜組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察大鼠腹膜形態(tài)改變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1動(dòng)物模型鑒定在尿毒癥模型復(fù)制過程中，若血清肌酐和尿素氮較正常組明顯升高，則視為尿毒癥模型成功。本實(shí)驗(yàn)檢測血清肌酐和尿素氮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組血清肌酐、尿素氮均明顯升高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01或P＜0.05），符合尿毒癥模型的特征；而與模型組相比，扶腎方中、高劑量組肌酐及尿素氮的含量有降低的趨勢，且高劑量組的降低趨勢更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明不同劑量的扶腎方均有降低血清肌酐和血清尿素氮的作用。見表3。

表3　血清肌酐與血清尿素氮含量（x±s）Tab.3　Serum creatinine and serum urea nitrogen（x±s）

2.2大鼠腹膜形態(tài)學(xué)改變HE染色結(jié)果顯示，正常組的大鼠壁層腹膜組織結(jié)構(gòu)相對完整，間皮下基質(zhì)較薄。與正常組相比，模型組有腹膜間皮細(xì)胞的變性、脫落，間皮下基質(zhì)明顯增厚，炎癥細(xì)胞浸潤以及血管增生。治療組相對模型組，腹膜間皮細(xì)胞相對連續(xù)，炎癥細(xì)胞浸潤和血管新生現(xiàn)象明顯減少，尤高劑量組的效果最為明顯。見圖1。

2.3TGF-β1、E-cadherin和α-SMA的水平結(jié)果顯示，模型組E-cadherin較正常組表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TGF-β1、α-SMA 較正常組表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，扶腎方干預(yù)后的各組E-cadherin表達(dá)均有所上調(diào)，且以高劑量組上調(diào)最為明顯（P＜0.01）；TGF-β1、α-SMA中、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜0.01），低劑量組較正常組有下調(diào)趨勢，但結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

3　討論

據(jù)中國慢性腎臟病流行病學(xué)調(diào)查，中國有1.2億慢性腎臟病人口和不少于100萬的尿毒癥患者群體[1]。腹膜透析（PD）作為一種對終末期腎臟?。‥SRD）的有效治療方式[2]，具有利于殘余腎功能保護(hù)，中分子溶質(zhì)清除較好，早期生存率、生活質(zhì)量更優(yōu)，患者疾病負(fù)擔(dān)小，可以更大程度回歸社會(huì)等優(yōu)勢，已在國家醫(yī)療衛(wèi)生層面和人民健康的戰(zhàn)略層面占據(jù)越來越重要的地位。據(jù)中國研究數(shù)據(jù)服務(wù)（CNRDS）數(shù)據(jù)，截止2013年底中國有腹膜透析患者 4.6萬人；而在全球范圍，腹膜透析患者已超25萬人。由于臨床最常用的腹膜透析液以葡萄糖為滲透劑，使得腹膜間皮細(xì)胞長期浸潤在腹透液中，而腹透液屬于生理不相容溶液，容易發(fā)生上皮EMT，導(dǎo)致腹膜纖維化，使得腹膜失去超濾能力，發(fā)生超濾衰竭。

圖1　大鼠腹膜HE染色結(jié)果（×200）Fig.1　HE staining of rat peritoneum（×200）

表 4　TGF-β1、E-cadherin 和 α-SMA 的水平（x±s）Tab.4　Levels of TGF-β1,E-cadherin and α-SMA（x±s）

腹膜纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、組織結(jié)構(gòu)重塑為主要特征，是導(dǎo)致臟器功能喪失的主要原因之一[3]。目前纖維化疾病的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制尚不明確，有研究提示炎癥反應(yīng)的激活、某些促纖維化因子的活化包含在纖維化的過程當(dāng)中[4-5]，部分分子信號(hào)通路已被證實(shí)參與腹膜纖維化的形成，包括TGFβ介導(dǎo)的信號(hào)通路，如Smad通路、PI3k/AKT/mTOR通路、MEK/ERK/NKκB通路、受體酪氨酸激酶（RTKs）介導(dǎo)的信號(hào)通路、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路等[6-7]。

EMT被認(rèn)為發(fā)生于腹膜纖維化的早期階段并在腹膜纖維化中起到了關(guān)鍵性的作用[8]。EMT以細(xì)胞間連接丟失（E-cadherin表達(dá)下調(diào)）、細(xì)胞骨架重塑（α-SMA表達(dá)上調(diào)），從而導(dǎo)致細(xì)胞極性丟失及梭形結(jié)構(gòu)的形成為特征。而作為長程PD患者的常見并發(fā)癥，腹膜纖維化可導(dǎo)致維持性PD患者出現(xiàn)腹膜超濾與轉(zhuǎn)運(yùn)功能衰竭，腹膜結(jié)構(gòu)和功能喪失，最終掉隊(duì)退出治療[9]。

隨著透析時(shí)間增長，腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的機(jī)制仍未完全明了，研究表明在纖維化早期有可能阻止甚至逆轉(zhuǎn)其病變，但具體都經(jīng)由何機(jī)制得以逆轉(zhuǎn)亦不確切可知。故而在此背景下，探尋能夠有效干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)長程PD基礎(chǔ)上腹膜纖維化進(jìn)程的分子機(jī)制即成為當(dāng)前亟待解決的重要臨床與科研現(xiàn)實(shí)問題。

研究發(fā)現(xiàn)[9]，上皮-EMT是早期腹膜損傷的關(guān)鍵一步，這個(gè)過程表現(xiàn)為細(xì)胞間連接受損、骨架重排以及基底膜降解，進(jìn)而細(xì)胞呈現(xiàn)游走性和侵襲性的特征，此時(shí)，細(xì)胞間黏附連接蛋白E-cadherin表達(dá)進(jìn)行性下降，α-SMA作為一種細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記蛋白表達(dá)增強(qiáng)[10-11]，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，同時(shí)還能增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致其過度沉積，是引起腹膜纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。本實(shí)驗(yàn)在SD大鼠尿毒癥模型的基礎(chǔ)上制備腹膜纖維化的模型，此模型貼近臨床實(shí)際。通過檢測動(dòng)物模型的肌酐及尿素氮指標(biāo)，其值明顯升高，HE染色見腹膜間皮細(xì)胞的變性、脫落，間皮下基質(zhì)增厚，炎癥細(xì)胞浸潤以及血管增生，腹膜轉(zhuǎn)分化的相關(guān)指標(biāo)E-cadherin表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢，符合腹膜纖維化特征。而在給予不同劑量的扶腎方用藥干預(yù)后，炎癥細(xì)胞浸潤以及血管增生現(xiàn)象較模型組明顯減少，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，α-SMA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的下調(diào)趨勢，研究結(jié)果提示腹膜EMT與E-cadherin和α-SMA的表達(dá)密切相關(guān)。

TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）生長因子家族成員之一，分布在多種細(xì)胞內(nèi)，在腎臟表達(dá)量最高，活性最強(qiáng)，是一種多向性，多效性的細(xì)胞因子，通過細(xì)胞表面的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期、增殖分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成以及免疫等功能[12-13]，是一種有助于調(diào)節(jié)腹膜纖維化的促細(xì)胞因子[14]，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，同時(shí)還能通過增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成并減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致其過度沉積，最終導(dǎo)致相關(guān)組織的纖維化。長期腹膜透析的患者AGEs在腹膜周圍存在大量蓄積，并伴有TGF-β1的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生[15]。

本實(shí)驗(yàn)TGF-β1的檢測結(jié)果中，經(jīng)扶腎方干預(yù)后，TGF-β1的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)趨勢，提示扶腎方通過抑制受體復(fù)合物的形成而抑制腹膜纖維化。

中醫(yī)理論認(rèn)為，慢性腎臟病的病變根本是腎氣虧虛，病機(jī)關(guān)鍵在于腎臟主水封藏功能和失職所致。其中陰陽失調(diào)是核心，“陰平陽秘，精神乃治”，是腎臟乃至全身臟器免受病變侵害的關(guān)鍵。正如《素問·生氣通天論》所謂“陰平陽秘”，即人體陰陽動(dòng)態(tài)平衡協(xié)調(diào)是健康的根本。腹膜透析系慢性腎功能衰竭終末期的替代治療手段，此時(shí)患者病程遷延，多呈脾腎虧虛，正氣不足之象，同時(shí)久病血瘀，經(jīng)絡(luò)澀滯，水濕不運(yùn)，濁毒化生，日久瘀濁互結(jié)，癥瘕內(nèi)見，而呈邪實(shí)留戀之勢。因此，該階段臨床遣方用藥尤須慎重精當(dāng)，以免偏頗叢生，影響疾病向愈。因此治療中應(yīng)在調(diào)補(bǔ)陰陽的基礎(chǔ)上，重視和解少陽，調(diào)和氣血，即運(yùn)用“和法”，和緩地調(diào)整機(jī)體的陰陽失調(diào)、升降失常、氣血失和。

和法是中醫(yī)傳統(tǒng)治療八法之一,是利用藥物的疏通調(diào)和作用,以達(dá)解除病邪,或調(diào)和臟腑、陰陽、表里失調(diào)之證得以解除,屬于調(diào)整人體機(jī)能的一種方法[16]。扶腎方以中醫(yī)學(xué)“和法”理論為宗，以療效確切的經(jīng)方對藥為基礎(chǔ)，融“和”、“補(bǔ)”、“消”為一體[17]，組方合理精當(dāng),選藥簡約質(zhì)樸。其以和法為總則，用藥和緩，平調(diào)陰陽；補(bǔ)瀉兼施，扶正祛邪，性質(zhì)平和，統(tǒng)籌兼顧。方用陳皮、半夏、黃芪、當(dāng)歸、仙靈脾、丹參、大黃、鬼箭羽等組方。既往研究證實(shí)扶腎顆粒可有效延緩腹膜纖維化進(jìn)程，進(jìn)而提高透析效能，改善患者生存質(zhì)量[18-19]。

綜上所述，本課題研究結(jié)果顯示，扶腎方各組與模型組對比，抑制TGF-β1表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin表達(dá)，其表達(dá)進(jìn)行性上調(diào)，同時(shí)抑制α-SMA表達(dá)，進(jìn)行性下調(diào)α-SMA表達(dá)，且隨著扶腎方劑量的加大，其作用更加明顯，說明扶腎方在腹膜組織纖維化EMT過程中起著一定作用。為臨床上進(jìn)一步運(yùn)用中醫(yī)藥減輕腹膜損傷，延緩腹膜纖維化提供了理論支持，也為提高患者的生活質(zhì)量，延長生存期提供了可能。